李進(jìn)波　查中萍　萬丙良　戚華雄

摘要：根據(jù)ＲＮＡｉ表達(dá)載體的設(shè)計(jì)原則，以ＴＷＨ基因?yàn)榘谢颍瑢㈤L度２５３ｂｐ目的片段通過正反兩個(gè)方向插入表達(dá)載體ｐＲ１３０１中，構(gòu)建ＲＮＡｉ表達(dá)載體ｐＲ１３０１－ＴＷＨ。通過根癌農(nóng)桿菌ＥＨＡ１０５介導(dǎo)法將其導(dǎo)入水稻品種武育粳３號(hào)，獲得３４株陽性轉(zhuǎn)基因植株，為進(jìn)一步深入研究ＴＷＨ基因功能奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：水稻（OryzasativaL.）；ＴＷＨ基因；ＲＮＡｉ（ＲＮＡｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ）；載體構(gòu)建；遺傳轉(zhuǎn)化

中圖分類號(hào)：Ｓ５１１；Ｑ７８１ 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：Ａ 文章編號(hào)：0439－８114（２０12）24－5791-03

ＲＮＡ干涉（ＲＮＡｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ，ＲＮＡｉ）是指內(nèi)源性或外源性雙鏈ＲＮＡ（ｄｏｕｂｌｅ－ｓｔｒａｎｄｅｄＲＮＡ，ｄｓＲＮＡ）介導(dǎo)的同源ｍＲＮＡ發(fā)生特異性降解，導(dǎo)致靶基因的表達(dá)沉默從而產(chǎn)生相應(yīng)的功能表型的缺失現(xiàn)象，屬于轉(zhuǎn)錄后的基因沉默現(xiàn)象。ＲＮＡｉ是在研究秀麗新小桿線蟲中被首次發(fā)現(xiàn)［１］，利用這一技術(shù)可以有效、特異性降解靶標(biāo)基因ｍＲＮＡ，阻止靶標(biāo)基因的表達(dá)，從而研究目標(biāo)基因的功能。

目前，水稻中已有許多利用ＲＮＡｉ技術(shù)進(jìn)行基因功能分析或驗(yàn)證的報(bào)道［２－４］。從水稻育種后代材料中發(fā)現(xiàn)一個(gè)水稻穎殼扭曲突變體，該突變體主要表現(xiàn)為穎殼扭曲變形，子粒充實(shí)不飽滿［５］。進(jìn)一步的研究結(jié)果表明，該突變體穎殼扭曲性狀受一對(duì)隱性基因控制，其對(duì)應(yīng)的ＴＷＨ基因被精細(xì)定位在第二染色體的ＳＳＲ標(biāo)記ＲＭＬ２５和ＲＭＬ３５之間，兩個(gè)ＳＳＲ標(biāo)記間的物理距離為１１．９ｋｂ，并確定了其候選基因。該研究通過構(gòu)建水稻ＴＷＨ基因的ＲＮＡｉ表達(dá)載體，利用根癌農(nóng)桿菌ＥＨＡ１０５介導(dǎo)法將其導(dǎo)入水稻品種武育粳３號(hào)中，獲得了轉(zhuǎn)基因水稻植株，為ＴＷＨ基因的功能研究奠定了基礎(chǔ)。

１ 材料與方法

１．１ 試劑

１．２ 載體及菌株

１．３ 植物材料和遺傳轉(zhuǎn)化方法

供試水稻材料為武育粳３號(hào)成熟種子誘導(dǎo)初生愈傷組織，作為與農(nóng)桿菌共培養(yǎng)轉(zhuǎn)化的受體材料。水稻的組織培養(yǎng)、農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化水稻以及抗性愈傷組織的篩選與植株再生等參照劉巧泉等［６］建立的高效轉(zhuǎn)化方法進(jìn)行。

１．４ ＰＣＲ引物設(shè)計(jì)及目的片段擴(kuò)增

１．５ 目的片段的克隆

將目的片段切下，通過膠回收試劑盒回收ＰＣＲ產(chǎn)物并純化后連接到ｐＭＤ１８－Ｔ載體上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌ＤＨ５α感受態(tài)細(xì)胞，涂布在含１００ｍｇ／Ｌ氨芐青霉素的Ｘ－Ｇａｌ／ＩＰＴＧ的ＬＢ固體培養(yǎng)基上，３７℃培養(yǎng)過夜，挑取白色單菌落于含１００ｍｇ／Ｌ氨芐青霉素的ＬＢ液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜，通過菌落ＰＣＲ篩選陽性克隆，獲得重組載體ｐＭＤ１８－Ｔ－ＴＷＨ，將陽性克隆送南京金斯瑞生物科技有限公司測(cè)序。

１．６ ＲＮＡｉ表達(dá)載體的構(gòu)建

１．７ 轉(zhuǎn)基因植株的ＰＣＲ檢測(cè)

２ 結(jié)果與分析

２．１ ＲＮＡｉ表達(dá)載體構(gòu)建

２．２ 水稻遺傳轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)基因植株的獲得

以武育粳３號(hào)成熟胚誘導(dǎo)的愈傷組織作為轉(zhuǎn)化受體，經(jīng)根癌農(nóng)桿菌ＥＨＡ１０５介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法將表達(dá)載體ｐＲ１３０１－ＴＷＨ導(dǎo)入水稻中。經(jīng)潮霉素抗性篩選，選擇生長旺盛的抗性愈傷組織進(jìn)行分化再生培養(yǎng)，最終獲得４０株T0代轉(zhuǎn)基因植株。以轉(zhuǎn)基因植株葉片總ＤＮＡ為模板，用潮霉素基因特異引物Ｐ７與Ｐ８進(jìn)行ＰＣＲ檢測(cè)（圖５），共有３４株檢測(cè)到５１７ｂｐ左右的目標(biāo)片段，ＰＣＲ陽性率為８５％。

３ 小結(jié)與討論

１）雖然ＲＮＡ干涉在作用機(jī)制等方面還不十分清楚，但作為一種新的技術(shù)方法，已經(jīng)在各個(gè)不同的生物研究中被廣泛應(yīng)用。應(yīng)用ＲＮＡ干涉技術(shù)迅速地抑制目的基因的表達(dá)，能盡快了解到目的基因的功能。該研究將構(gòu)建的表達(dá)載體ｐＲ１３０１－ＴＷＨ導(dǎo)入水稻愈傷組織中，獲得了陽性轉(zhuǎn)基因植株，下一步計(jì)劃將轉(zhuǎn)基因苗移栽到海南試驗(yàn)基地，抽穗后進(jìn)行表型鑒定和表達(dá)分析，研究ＴＷＨ基因的功能。

２）載體設(shè)計(jì)是載體構(gòu)建的關(guān)鍵。由于ＲＮＡｉ機(jī)制只對(duì)成熟的ｍＲＮＡ產(chǎn)生作用，因此用于設(shè)計(jì)ＲＮＡ干涉載體的靶序列應(yīng)處于基因的一個(gè)外顯子內(nèi)。Ｗｅｓｌｅｙ等［７］的研究表明ＲＮＡｉ片段的長度在９８～８５３ｎｔ之間都是可行的，不會(huì)對(duì)沉默效率產(chǎn)生明顯影響；同時(shí)將間隔區(qū)內(nèi)含子插入反向互補(bǔ)重復(fù)區(qū)可以增強(qiáng)其穩(wěn)定性。因此，在本研究中我們選擇ＴＷＨ基因一個(gè)外顯子部分的２５３ｂｐ為靶序列構(gòu)建ＲＮＡｉ載體，并在兩個(gè)反向重復(fù)序列間加入一個(gè)Ｗａｘｙ基因的內(nèi)含子作為間隔區(qū)，目的是為了提高轉(zhuǎn)基因后代的沉默效率，有效抑制目的基因的表達(dá)。

參考文獻(xiàn)：

［１］ＦＩＲＥＡ，ＸＵＳＱ，ＭＯＮＴＧＯＭＥＲＹＭＫ，ｅｔａｌ．Ｐｏｔｅｎｔａｎｄｓｐｅｃｉｆｉｃｇｅｎｅｔｉｃｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅｂｙｄｏｕｂｌｅ－ｓｔｒａｎｄｅｄＲＮＡｉｎＣａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓｅｌｅｇａｎｓ［Ｊ］．Ｎａｔｕｒｅ，１９９８，３９１（６６６９）：８０６－８１１．

［２］ＣＨＥＮＪ，ＴＡＮＧＷＨ，ＨＯＮＧＭＭ，ｅｔａｌ．ＯｓＢＰ－７３，ａｒｉｃｅｇｅｎｅ，ｅｎｃｏｄｅｓａｎｏｖｅｌＤＮＡ－ｂｉｎｄｉｎｇｐｒｏｔｅｉｎｗｉｔｈａＳＡＰ－ｌｉｋｅｄｏｍａｉｎａｎｄｉｔｓｇｅｎｅｔｉｃｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅｂｙｄｏｕｂｌｅ－ｓｔｒａｎｄｅｄＲＮＡｉｎｈｉｂｉｔｓｒｉｃｅｇｒｏｗｔｈ［Ｊ］．ＰｌａｎｔＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，２００３，５２（３）：５７９－５９０．

［３］ＰＲＡＳＡＤＫ，ＶＩＪＡＹＲＡＧＨＡＶＡＮＵ．Ｄｏｕｂｌｅ－ｓｔｒａｎｄｅｄＲＮＡｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅｏｆａｒｉｃｅＰＩ／ＧＬＯｐａｒａｌｏｇ，ＯｓＭＡＤＳ２，ｕｎｃｏｖｅｒｓｉｔｓｓｅｃｏｎｄ－ｗｈｏｒｌ－ｓｐｅｃｉｆｉｃｆｕｎｃｔｉｏｎｉｎｆｌｏｒａｌｏｒｇａｎｐａｔｔｅｒｎｉｎｇ［Ｊ］．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，２００３，１６５（４）：２３０１－２３０５．

［４］ＸＩＡＯＨ，ＷＡＮＧＹ，ＬＩＵＤ，ｅｔａｌ．ＦｕｎｃｔｉｏｎａｌａｎａｌｙｓｉｓｏｆｔｈｅｒｉｃｅＡＰ３ｈｏｍｏｌｏｇｕｅＯｓＭＡＤＳ１６ｂｙＲＮＡｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ［Ｊ］．ＰｌａｎｔＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，２００３，５２（５）：９５７－９６６．

［５］ＬＩＪＢ，ＸＩＡＭＹ，ＷＡＮＢＬ，ｅｔａｌ．ＧｅｎｅｔｉｃａｎａｌｙｓｉｓａｎｄｍａｐｐｉｎｇｏｆＴＷＨｇｅｎｅｉｎｒｉｃｅｔｗｉｓｔｅｄｈｕｌｌｍｕｔａｎｔ［Ｊ］．ＲｉｃｅＳｃｉｅｎｃｅ，２００９，１６（１）：７９－８２．

［６］劉巧泉，張景六．根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的水稻高效轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的建立［Ｊ］．植物生理學(xué)報(bào)，１９９８，２４（３）：２５９－２７１．

［７］ＷＥＳＬＥＹＳＶ，ＨＥＬＬＩＷＥＬＬＣＡ，ＳＭＩＴＨＮＡ，ｅｔａｌ．Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｄｅｓｉｇｎｆｏｒｅｆｆｉｃｉｅｎｔ，ｅｆｆｅｃｔｉｖｅａｎｄｈｉｇｈ－ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔｇｅｎｅｓｉｌｅｎｃｉｎｇｉｎｐｌａｎｔｓ［Ｊ］．ＴｈｅＰｌａｎｔＪｏｕｒｎａｌ，２００１，２７（６）：５８１－５９０．