王婧　楊潔等

摘要：為了尋找操作簡(jiǎn)便、耗時(shí)短、成本低的適用于簡(jiǎn)單重復(fù)序列－聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（ＳＳＲ－ＰＣＲ）試驗(yàn)的水稻基因組ＤＮＡ提取方法，試驗(yàn)以３種類型的水稻樣品（葉片、米粒、米粉）為材料，比較了十六烷基三甲基溴化銨（ＣＴＡＢ）法、試劑盒法、蔗糖法、堿法４種基因組ＤＮＡ提取方法對(duì)水稻基因組ＤＮＡ提取質(zhì)量的影響。結(jié)果表明，ＣＴＡＢ法提取的葉片、米粒和米粉的基因組ＤＮＡ含量最高，其次為試劑盒法提取的葉片、米粉和堿法提取的米粉的基因組ＤＮＡ含量。通過(guò)４種方法得到的水稻基因組ＤＮＡ純度均不高，但不影響后續(xù)的ＳＳＲ－ＰＣＲ試驗(yàn)。ＳＳＲ－ＰＣＲ結(jié)果表明，ＣＴＡＢ法、試劑盒法和堿法提取的３種樣品類型的水稻基因組ＤＮＡ的擴(kuò)增均表現(xiàn)出了良好的重復(fù)性。其中試劑盒法的提取成本最高，ＣＴＡＢ法耗時(shí)最長(zhǎng)。整體而言，堿法是最適合水稻ＳＳＲ－ＰＣＲ試驗(yàn)的基因組ＤＮＡ提取方法，且以米粉為提取材料時(shí)效果最佳。

關(guān)鍵詞：水稻；基因組ＤＮＡ；提取方法

中圖分類號(hào)：Ｓ５１１；Ｑ５２３；Ｑ７８１ 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：Ａ 文章編號(hào)：0439－８114（２０12）24－5794-04

水稻（ＯｒｙｚａｓａｔｉｖａＬ．）是世界上三大糧食作物之一，中國(guó)的稻田面積占世界稻田面積的２２％［１］。在水稻和其他大多數(shù)作物中，以聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ，ＰＣＲ）技術(shù)為基礎(chǔ)的分子標(biāo)記分析如簡(jiǎn)單重復(fù)序列（Ｓｉｍｐｌｅｓｅｑｕｅｎｃｅｒｅｐｅａｔ，ＳＳＲ）標(biāo)記由于其具有多態(tài)性好、可靠性高、技術(shù)簡(jiǎn)單、價(jià)格便宜和ＤＮＡ模板使用量低等優(yōu)點(diǎn)，在分子生物學(xué)技術(shù)中得到了廣泛的應(yīng)用。ＤＮＡ提取是ＳＳＲ－ＰＣＲ分析的前提。在這一研究中，往往要對(duì)幾十個(gè)乃至幾百個(gè)樣品提取的基因組ＤＮＡ進(jìn)行ＳＳＲ分析。這就需要進(jìn)行大量的ＤＮＡ提取工作，而常規(guī)ＤＮＡ提取過(guò)程比較復(fù)雜，是分子標(biāo)記分析效率提高及成本降低的關(guān)鍵性因素［２］。事實(shí)上，針對(duì)ＳＳＲ的ＰＣＲ技術(shù)對(duì)ＤＮＡ質(zhì)量的要求不是很高，運(yùn)用一些簡(jiǎn)單快速的方法獲得的基因組ＤＮＡ就可以滿足其需要。因而發(fā)展簡(jiǎn)便快速提取基因組ＤＮＡ的方法就顯得尤為重要。目前，國(guó)內(nèi)外已建立了多種基因組ＤＮＡ的提取方法，這些方法因所研究的對(duì)象和目的不同而有一定的差異，主要是十六烷基三甲基溴化銨（Ｃｅｔｙｌｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍｂｒｏｍｉｄｅ，ＣＴＡＢ）法、堿法和蔗糖法等，并且多數(shù)方法是基于葉片的基因組ＤＮＡ提取為前提［３－７］，所以基于種子基因組ＤＮＡ的提取方法也日益受到研究者的重視［８］，但基于米粉的基因組ＤＮＡ提取方法卻鮮有報(bào)道。試驗(yàn)比較了以３種類型的水稻樣品（葉片、米粒、米粉）為材料的４種基因組ＤＮＡ提取方法（ＣＴＡＢ法、試劑盒法、蔗糖法、堿法）提取的基因組ＤＮＡ濃度和質(zhì)量，并分析了ＳＳＲ－ＰＣＲ檢測(cè)結(jié)果，試圖找出操作簡(jiǎn)便、耗時(shí)短、成本低的水稻基因組ＤＮＡ提取方法。

１ 材料與方法

１．１ 材料

水稻品系為Ｋ４７８、Ｋ４８０、Ｋ４８２，由湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院糧食作物研究所提供；將試驗(yàn)里進(jìn)行基因組ＤＮＡ提取的樣品類型分為３類：Ａ，正常條件下發(fā)芽７ｄ的水稻幼嫩葉片樣品；Ｂ，單株種子樣品；Ｃ，１粒去殼的水稻種子經(jīng)植物球磨儀研磨后所得到的米粉樣品。

１．２ ＤＮＡ提取方法

１．２．４ 方法４ 參考植物基因組ＤＮＡ提取試劑盒的操作手冊(cè)里提取與純化基因組ＤＮＡ的有關(guān)方法，將3種樣品進(jìn)行相關(guān)處理，得到可以用做ＰＣＲ模板的材料溶液。

２ 結(jié)果與分析

２．１ 核酸蛋白檢測(cè)儀檢測(cè)水稻基因組ＤＮＡ純度與含量

２．２ ＳＳＲ－ＰＣＲ擴(kuò)增

以４種方法提取不同材料類型的３個(gè)水稻品系ＤＮＡ為模板，選?。矊?duì)ＳＳＲ引物ＲＭ３３６和ＲＭ２９７擴(kuò)增水稻的ＤＮＡ樣品，結(jié)果見(jiàn)圖１、圖２。從圖１、圖２可見(jiàn)，４種方法提取的水稻基因組ＤＮＡ大多數(shù)都擴(kuò)增出了電泳條帶，雖然不同樣品的質(zhì)量及濃度明顯不同，而且所有樣品都存在不同程度的污染現(xiàn)象，但這些因素顯然沒(méi)有對(duì)ＰＣＲ擴(kuò)增造成明顯的影響。引物ＲＭ３３６和ＲＭ２９７擴(kuò)增的帶型在某些樣品間存在一定差異，能夠反映出這些樣品的基因型不同，說(shuō)明４種方法提取的水稻基因組ＤＮＡ完全能滿足ＳＳＲ-PCR分析的需要，可用于種子真實(shí)性和純度的快速鑒定。其中ＣＴＡＢ法、堿法和試劑盒法提取不同材料類型的水稻基因組ＤＮＡ擴(kuò)增結(jié)果都得到了較好地重復(fù)，說(shuō)明這３種方法提取的水稻基因組ＤＮＡ用于ＳＳＲ-PCR試驗(yàn)結(jié)果穩(wěn)定；而蔗糖法的擴(kuò)增成功率則低于其他３種方法，說(shuō)明蔗糖法提取的水稻基因組ＤＮＡ含量偏低。

２．３ ４種ＤＮＡ提取方法的成本分析

３ 小結(jié)與討論

ＳＳＲ分子標(biāo)記具有數(shù)量豐富、多態(tài)性高、結(jié)果穩(wěn)定可靠等優(yōu)點(diǎn)，因此在作物品種純度鑒定［１３］、遺傳多樣性分析［１４］等方面得到了日益廣泛的應(yīng)用。雖然ＳＳＲ分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)模板ＤＮＡ純度和含量的要求不高，但是高質(zhì)量的ＤＮＡ是檢測(cè)結(jié)果穩(wěn)定可靠并有較高重復(fù)性的有力保障。目前，ＤＮＡ提取方法種類繁多，有傳統(tǒng)的ＳＤＳ法、ＣＴＡＢ法，簡(jiǎn)化后的堿法和蔗糖法等，但在效率上仍然有改進(jìn)的空間。尤其是對(duì)大批量的水稻樣品進(jìn)行ＳＳＲ分析時(shí)，需要尋找一種操作簡(jiǎn)便、耗時(shí)短、成本低且又能保證擴(kuò)增質(zhì)量的最適水稻基因組ＤＮＡ提取方法。因此有必要在現(xiàn)有基礎(chǔ)上進(jìn)一步簡(jiǎn)化和比較各種提取方法。

通過(guò)比較ＣＴＡＢ法、試劑盒法、蔗糖法、堿法提取的水稻基因組ＤＮＡ，發(fā)現(xiàn)以ＣＴＡＢ法提取的水稻葉片、米粒和米粉的水稻基因組ＤＮＡ含量最高，其次是試劑盒法提取的葉片、米粉和堿法提取的米粉的水稻基因組ＤＮＡ含量較高，反映出最大限度地使水稻樣品均勻分散而得到的米粉樣品成為了提?。模危磷罴训牟牧闲螒B(tài)。同時(shí)發(fā)現(xiàn)４種方法提取的ＤＮＡ純度均不高，其中以試劑盒法和ＣＴＡＢ法較好，原因可能是堿法和蔗糖法在提取ＤＮＡ?xí)r只保留了裂解組織、ＤＮＡ沉淀和溶解等主要步驟，而摒棄了蛋白質(zhì)和有機(jī)物清除等中間步驟，導(dǎo)致提取的ＤＮＡ中存在蛋白質(zhì)、糖類、有機(jī)物小分子等物質(zhì)的污染，進(jìn)而降低了純度。ＳＳＲ－ＰＣＲ結(jié)果顯示，ＣＴＡＢ法、試劑盒法和堿法提取不同類型材料的ＤＮＡ擴(kuò)增結(jié)果都得到了很好地重復(fù)，說(shuō)明這３種方法提取的ＤＮＡ用于ＳＳＲ試驗(yàn)結(jié)果穩(wěn)定。但其中試劑盒法的提取成本很高，提取每１００個(gè)樣品的成本高達(dá)５７２．０８元，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其余３種方法；而ＣＴＡＢ法耗時(shí)很長(zhǎng)，提取每個(gè)樣品的時(shí)間是耗時(shí)最短的堿法的７倍左右。

綜上可知，堿法提取水稻基因組ＤＮＡ是４種方法中性價(jià)比最高的方法，尤其以米粉作為材料提取ＤＮＡ效果最佳。該方法制備模板操作時(shí)間短、效率高、重復(fù)性好、成本低，并且制備過(guò)程無(wú)需使用有機(jī)溶劑，可避免有機(jī)試劑對(duì)人體的毒害作用。因此，用堿法快速地從大量樣本中提取水稻基因組ＤＮＡ進(jìn)行ＰＣＲ擴(kuò)增，可廣泛地應(yīng)用于水稻基因組ＤＮＡ分子標(biāo)記相關(guān)的科學(xué)試驗(yàn)及生產(chǎn)實(shí)踐中。

參考文獻(xiàn)：

［１］蓋鈞鎰．作物育種學(xué)各論［Ｍ］．北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，２００６．２７－３３．

［２］ＸＩＮＺ，ＶＥＬＴＥＮＪＰ，ＯＬＩＶＥＲＭＪ，ｅｔａｌ．Ｈｉｇｈ－ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔＤＮＡｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄｓｕｉｔａｂｌｅｆｏｒＰＣＲ［Ｊ］．ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，２００３，３４（4）：８２０－８２６．

［３］桑賢春，何光華，張 毅，等．水稻ＰＣＲ擴(kuò)增模板的快速制備［Ｊ］．遺傳，２００３，２５（６）：７０５－７０７．

［４］汪秀峰，楊劍波，向太和，等．一種葉片直接用作ＰＣＲ擴(kuò)增的新方法及其應(yīng)用［Ｊ］．中國(guó)水稻科學(xué)，２００２，１６（１）：６７－７０．

［５］邱福林，王和和，陳 潔，等．用于水稻突變體大量篩選的ＤＮＡ微量快速提取法［Ｊ］．中國(guó)水稻科學(xué)，２００６，２０（３）：３２９－３３２．

［６］ＩＫＥＤＡＮ，ＢＡＵＴＩＳＴＡＮＳ，ＹＡＭＡＤＡＴ，ｅｔａｌ．Ｕｌｔｒａ－ｓｉｍｐｌｅＤＮＡｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄｆｏｒｍａｒｋｅｒ－ａｓｓｉｓｔｅｄｓｅｌｅｃｔｉｏｎｕｓｉｎｇｍｉｃｒｏｓａｔｅｌｌｉｔｅｍａｒｋｅｒｓｉｎｒｉｃｅ［Ｊ］．ＰｌａｎｔＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙＲｅｐｏｒｔｅｒ，２００１，１９（1）：２７－３２．

［７］ＣＯＬＬＡＲＤＢＣＹ，ＤＡＳＡ，ＶＩＲＫＰ，ｅｔａｌ．Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎｏｆ‘ｑｕｉｃｋａｎｄｄｉｒｔｙＤＮＡｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄｓｆｏｒｍａｒｋｅｒ－ａｓｓｉｓｔｅｄｓｅｌｅｃｔｉｏｎｉｎｒｉｃｅ（OryzasativaL.）［Ｊ］．ＰｌａｎｔＢｒｅｅｄｉｎｇ，２００７，１２６（1）：４７－５０．

［８］ＧＡＯＳ，ＭＡＲＴＩＮＥＺＣ，ＳＫＩＮＮＥＲＤ，ｅｔａｌ．ＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｏｆａｓｅｅｄＤＮＡ－ｂａｓｅｄｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇｓｙｓｔｅｍｆｏｒｍａｒｋｅｒ－ａｓｓｉｓｔｅｄｓｅｌｅｃｔｉｏｎｉｎｍａｉｚｅ［Ｊ］．ＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｒｅｅｄｉｎｇ，２００８，２２（3）：４７７－４９４．

［９］彭鎖堂，顏啟傳，王學(xué)德，等．水稻單粒種子ＤＮＡ提取及ＲＡＰＤ程序優(yōu)化研究［Ｊ］．上海交通大學(xué)學(xué)報(bào)（農(nóng)業(yè)科學(xué)版），２００２，２０（１）：３４－４１．

［１０］樓巧君，陳 亮，羅利軍．三種水稻基因組ＤＮＡ快速提取方法的比較［Ｊ］．分子植物育種，２００５，３（５）：７４９－７５２．

［１１］閆雙勇，蘇京平，王勝軍，等．一種同時(shí)適用于水稻種子和葉片的簡(jiǎn)單快速提取方法［Ｊ］．中國(guó)稻米，２０１１，１７（５）：１１－１３．

［１２］宋豐順，倪大虎，陸徐忠，等．水稻單粒種子ＤＮＡ的快速制備及ＰＣＲ分析［Ｊ］．安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，２００７，３５（２１）：６３７１－６３７２．

［１３］蘇順宗，黃玉碧，楊俊品，等．利用ＳＳＲ鑒定水稻雜交種子純度的研究［Ｊ］．種子，２００３，２２（１）：２３－2５．

［１４］王金花，羅文勇，陳建偉，等．應(yīng)用ＳＳＲ和ＩＳＳＲ標(biāo)記分析栽培香稻品種的遺傳多樣性［Ｊ］．分子植物育種，２００５，３（１）：３７－４２．