葛平等

[摘要]目的：探討平陽霉素誘導人血管瘤內皮細胞凋亡過程中PARP-1、Cyt-C的表達及可能機制。方法：在體外培養(yǎng)人血管瘤內皮細胞，設立兩組：A組為平陽霉素組，其中加入平陽霉素（200μg/ml），誘導血管瘤內皮細胞凋亡，B組為空白對照組。對兩組血管瘤內皮細胞通過倒置顯微鏡、電鏡觀察其形態(tài)學變化，采用流式細胞儀檢測平陽霉素誘導血管瘤內皮細胞的凋亡率。利用基因芯片技術篩選出差異表達的基因，從中選定PARP-1及Cyt-C表達基因，對其進行RT-PCR驗證。結果：平陽霉素（200μg/ml）可以誘導體外培養(yǎng)的人血管瘤內皮細胞凋亡，加藥24h后，在倒置顯微鏡和電鏡下觀察到明顯的細胞凋亡的形態(tài)學改變，流式細胞儀檢測凋亡率可達13.11%?？瞻讓φ战M血管瘤內皮細胞倒置顯微鏡下觀察無明顯形態(tài)學變化，流式細胞儀檢測凋亡率為3.56%。利用基因芯片技術篩選出兩組差異基因4752個，其中2543個上調，2209個下調。應用DAVID軟件對鑒定出來的差異基因進行生物信息學分析，從中選出與線粒體凋亡途徑直接相關的蛋白表達基因：PARP-1、Cyt-C。對其進行RT-PCR檢測得到的CT值顯示：平陽霉素藥物組相對于空白組PARP-1及Cyt-C蛋白基因呈高表達狀態(tài)。結論：平陽霉素在體外可以通過多種途徑誘導血管瘤內皮細胞發(fā)生凋亡，其中PARP-1及Cyt-C參與了線粒體途徑調控的凋亡。

[關鍵詞]血管瘤內皮細胞；凋亡；平陽霉素；PARP-1；Cyt-C

[中圖分類號]Q813.1[文獻標識碼]A[文章編號]1008-6455（2012）10-0-0

嬰幼兒血管瘤發(fā)病率為1%～2%，尤其發(fā)生于頜面部的約占全身的60%。血管瘤一般出現(xiàn)在出生時或出生后10～14天，大約有40%新生兒在出生時即發(fā)現(xiàn)血管瘤，有兩個生長高峰期，第一個高峰期為4～5月時，此期瘤體迅速增長，另一個生長高峰期為1歲左右，此期血管瘤大小達到最高峰，1～2歲時開始消退。雖然嬰幼兒血管瘤的生物學行為是可自行消退的，但血管瘤的消退周期較長（10～12年）、大面積血管瘤消退后會引起局部后遺癥（影響功能和美觀），且特殊部位的血管瘤可能引起嚴重并發(fā)癥、甚至威脅生命，這些都需要積極干預治療。

血管瘤的常規(guī)治療方法主要有口服或局部注射糖皮質激素、X線放療、放射性同位素注射或貼敷、抗腫瘤藥物局部注射、口服γ-干擾素、激光治療等。目前，臨床上治療血管瘤最廣泛的是局部注射平陽霉素硬化治療。但其誘導凋亡機制仍不明確。

近年來越來越多的實驗研究證明，嬰幼兒血管瘤其消退是內皮細胞凋亡（apoptosis）所致。多個學者研究發(fā)現(xiàn)增生期血管瘤組織中其細胞凋亡處于較低水平，是消退期細胞凋亡水平的5倍，并且內皮細胞占這些凋亡細胞的30%[1]。經(jīng)典的細胞凋亡途徑有兩條，第一條是細胞外途徑（細胞表面死亡受體通路），另一條是細胞內途徑（線粒體通路）。細胞外途徑主要涉及Fas/FasL及Caspases，而細胞內途徑主要與Bcl-2、Caspase9、Cyt-C（細胞色素C，cytochrome C）和Bax等相關。本研究旨從線粒體途徑闡述平陽霉素誘導血管瘤內皮細胞凋亡作用機制。通過體外培養(yǎng)的人血管瘤內皮細胞加入平陽霉素誘導其凋亡，尋找參與線粒體代謝異常及凋亡相關的蛋白表達基因，并對尋找出的蛋白表達基因進行驗證。從基因及亞細胞蛋白組學層面上對平陽霉素誘導血管瘤內皮細胞凋亡的分子機制進行深一步研究。為其理論研究提供新的實驗依據(jù)，為血管瘤的臨床治療提供新的思路及方法。

1材料和方法

1.1 材料：體外培養(yǎng)的人增殖期血管瘤內皮細胞由西安交通大學第二醫(yī)院小兒外科惠贈。傳代培養(yǎng)至第5～6代。主要儀器及試劑：BB16紫外清潔型培養(yǎng)箱（Heraeus美國）、DMLED型倒置顯微鏡（LEICA德國）、流式細胞儀（FACSCalibur美國）、RPMI-1640培養(yǎng)粉（含L-谷胺酰胺）（GIBCO公司）、標準胎牛血清（TMD天津）、氨芐青霉素（美國Sigma公司）、硫酸鏈霉素（美國Sigma公司）、胰蛋白酶（GIBCO公司）、Annexin V-FITC PI雙染細胞凋亡檢測試劑盒（上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司）。

1.2方法

1.2.1 倒置顯微鏡觀察細胞形態(tài)：分為未加藥物的空白對照組和加入平陽霉素（200μg/ml）藥物組（平陽霉素為商品化藥物）。將兩組細胞放入37℃，5%CO2的培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，每小時觀察細胞形態(tài)一次。待藥物作用于細胞24h后分別收集兩組細胞。

1.2.2 電鏡觀察藥物作用血管瘤內皮細胞凋亡：將收集到的兩組細胞分別制作切片，瑞典LKB-V型超薄切片機進行超薄切片50～70nm，醋酸鈾、檸檬酸鉛染色后，日本日立H-600透射電子顯微鏡下觀察、拍照。

1.2.3 流式細胞儀檢測凋亡率：離心收集細胞，用4℃預冷的PBS洗滌，1000rpm，10min；用250μl結合緩沖液重懸細胞，并使其濃度為1×106低溫500～1000r/min離心5min棄去染液；加入1.0ml PI染液，4℃避光染色15min； 400目的篩網(wǎng)過濾1次；上流式細胞儀檢測，并用隨機軟件分析。

1.2.4 基因芯片技術篩選差異基因：選用基因芯片為Agilent表達譜芯片（由陜西北美基因有限公司提供），按芯片操作要求檢測。

1.2.5 生物信息學分析與RT-PCR驗證：應用DAVID軟件對鑒定出來的差異基因進行生物信息學分析，從中選出與線粒體凋亡途徑直接相關的蛋白表達基因：PARP-1、Cyt-C。RT-PCR檢測差異基因。

2結果

2.1不同時間點藥物作用細胞反應：如圖1所示：（a）2h內，細胞均呈現(xiàn)典型的“鋪路石”狀排列，細胞偽足伸展充分，貼壁良好，界線清晰，細胞核清晰可辯；（b）8h，細胞間界線開始變得模糊，個別細胞偽足開始收縮變性，間隙有所增大；（c）24h，大部分細胞皺縮變圓，細胞間間隙明顯增大，細胞形態(tài)完整，部分細胞脫壁游離飄浮。

2.2 電鏡觀察結果：如圖2所示，a空白對照組：正常血管瘤內皮細胞，可見胞漿均一，細胞表面微絨毛存在，可見相對正常的線粒體及內質網(wǎng)結構，包膜完整。b、c平陽霉素組：腫瘤細胞電子密度增加，細胞表面微絨毛樣突起消失，細胞膜形態(tài)仍然完整，細胞核形態(tài)不規(guī)則，核內染色質凝聚形成高密度團塊，邊集，呈現(xiàn)典型的細胞凋亡變化。細胞內可見有凋亡小體形成。

2.3 流式細胞儀檢測結果：見圖3。

2.4 基因芯片結果：利用基因芯片技術篩選出兩組差異基因4752個，其中2543個上調，2209個下調。應用DAVID軟件對鑒定出來的差異基因進行生物信息學分析，從中選出與線粒體凋亡途徑直接相關的蛋白表達基因：PARP-1、Cyt-C。

2.5 RT-PCR驗證結果：RNA提取過程中可能發(fā)生各種途徑的降解，28S/18S即為衡量提取的RNA完整性的指標，經(jīng)凝膠電泳鑒定質量，圖4示28S/18S為1.8～2.0；表明所提取RNA完整性較好，基本無降解發(fā)生，證明其完整性。

3討論

目前認為細胞凋亡的途徑主要有兩條，一條是通過胞外信號激活細胞內的凋亡蛋白酶caspase；另一條是通過線粒體釋放凋亡蛋白酶激活因子來激活caspase。這些活化的caspase可將細胞內的重要蛋白降解，引起細胞凋亡。

3.1 線粒體除了為細胞提供基本生命活動的能量以外，它還負責著感受細胞內外的刺激及氧化壓力（oxidative stress）的大小，它在細胞內作為一個感應者（senser）[2-4]，根據(jù)外界刺激壓力的大小來決定細胞是否發(fā)生凋亡。當外界微小的刺激或氧化壓力作用于細胞的時候，線粒體會發(fā)生增生性變化，產生更多的能量（如三磷酸腺苷adenosine triphospate：ATP）來提供給細胞，以此來應對外界刺激及氧化壓力帶來的傷害，從而使細胞保持其固有生理功能的穩(wěn)定，繼續(xù)存活。當氧化壓力及外界刺激超過細胞內線粒體自我修復所能承受的極限時，線粒體的形態(tài)及結構就會發(fā)生改變，這種改變會使得Cyt-C及AIF（凋亡誘導因子，apoptosis-inducing factor）釋放并進入胞漿，這些細胞因子啟動caspase級聯(lián)反應，使細胞發(fā)生凋亡，以此方式清除體內那些衰老的、病態(tài)的、不健康的甚至發(fā)生突變的腫瘤細胞。以下三種機制是線粒體調控細胞凋亡的主要途徑[5-8]，包括：①電子傳遞、氧化磷酸化及ATP產生的破壞；②釋放細胞色素C來激發(fā)caspase級聯(lián)反應；③改變細胞氧化還原位能。當外界各種不同的環(huán)境刺激（如紫外線、γ射線、內質網(wǎng)壓力、生長因子缺失、氧化壓力）作用于細胞時，過量的活性氧族（reactive oxygen species：ROS）會在細胞內產生，這些活性氧族可誘導凋亡因子Bcl-2家族蛋白（如Bax和Bak）啟動，并在線粒體外膜上發(fā)生聚合，導致線粒體功能障礙，從而引發(fā)內源性途徑使細胞凋亡[9]。

3.2 平陽霉素（Pingyangmycin，PYM）是一種細胞毒性糖肽抗腫瘤抗生素。臨床研究證明，平陽霉素是一種療效好、毒性小的抗腫瘤抗生素。20余年來平陽霉素亦用于治療血管瘤，取得良好的效果，已成為血管瘤常規(guī)的治療方法之一[10-13]。平陽霉素治療血管瘤的可能機制有：①使組織纖維化的副作用，研究表明平陽霉素是一種血管形成抑制劑，可通過抑制血管形成而達到其治療作用；平陽霉素可以引起血管內膜管壁結構的病理改變及造成血管內皮細胞變性，促使血栓形成，并使瘤體纖維化，從而抑制血管瘤發(fā)展，使瘤體消退；②平陽霉素直接引起DNA單鏈斷裂，抑制細胞的代謝，干擾細胞的分裂增殖[14]；越來越多的研究證明平陽霉素可以有效的誘導血管瘤內皮細胞發(fā)生凋亡。本實驗結果顯示平陽霉素可以有效的誘導血管瘤內皮細胞凋亡，在倒置顯微鏡和電鏡下觀察到明顯的細胞凋亡的形態(tài)學改變，流式細胞儀檢測凋亡率可達13.11%。

本實驗利用基因芯片，應用DAVID軟件對鑒定出來的差異基因進行生物信息學分析，從中選出與線粒體凋亡途徑直接相關的蛋白表達基因：PARP-1[聚腺苷酸二磷酸核糖轉移酶，poly（ADP-ribose） polymerase-1]、Cyt-C，并對其進行RT-PCR驗證。結果說明平陽霉素誘導血管瘤內皮細胞凋亡與PARP-1、Cyt-C介導的線粒體途徑密切相關，目前尚無相關研究報道。

3.3 PARP-1在細胞凋亡中扮演的角色：PARP-1是一種廣泛存在于真核細胞中，并在細胞生命循環(huán)中有重要作用的核因子，該蛋白家族的其它成員包括PARP-2、PARP-3、V-PARP和tankyrases。它的功能是探測DNA損傷，通過特異識別和綁定DNA損傷，使自身激活，對DNA修復和維持基因的穩(wěn)定性有重要作用。

在經(jīng)典的細胞凋亡途徑中， PARP-1被caspase3和caspase7切割為p89和p21兩個片段， 抑制其DNA修復功能， 使細胞內ATP不至于被PARP-1耗竭， 從而保證凋亡過程中的能量供應。然而PARP-1并不僅僅作為死亡底物被動地參與細胞凋亡，PARP-1過度激活能通過引起線粒體損傷， 誘發(fā)非caspase依賴的細胞凋亡。有研究認為除細胞核外， 還有一部分PARP-1定位于線粒體， 在過度激活時直接引起線粒體損傷和促凋亡蛋白的釋放。另一種可能是， PARP-1 通過其它信號分子引起線粒體功能受損。

本次實驗發(fā)現(xiàn)平陽霉素誘導血管瘤內皮細胞凋亡過程中PARP-1表達基因呈高表達。我們推測：平陽霉素誘導細胞凋亡的途徑可能為：PARP-1可以修復受損DNA，當藥物致DNA大量受損時，PARP-1的過度活化會使細胞能量儲存耗竭，導致細胞凋亡。同時，PARP-1低水平的活化也可以使線粒體釋放AIF和Cyt-c，從而導致細胞凋亡。

3.4 Cyt C在細胞凋亡中扮演的角色：Cyt-C由線粒體所釋放，是一種可以導致細胞凋亡的細胞因子。細胞色素C是一種水溶性蛋白，由兩種前驅分子組成，這兩種分子均位于線粒體內外膜的間隙內，分別是：細胞核基因所負責的前細胞色素C（procytochrome C）和線粒體內合成的亞鐵血紅素（ferrohemoglobin）。亞鐵血紅素基團在細胞呼吸鏈中有重要作用，由于Cyt C具有此基團，因此可以在細胞色素還原酶及細胞色素氧化酶之間傳遞電子；當Cyt C缺乏時，這種電子的傳遞則會受阻，從而導致ATP合成的減少，進一步引起線粒體的能量供應障礙[15-17]。當線粒體外膜通道蛋白發(fā)生改變時，某些特異性凋亡因子則被釋放出來。Cyt C自線粒體釋放至細胞漿為誘導細胞凋亡的重要環(huán)節(jié)，由線粒體釋放Cyt C介導活化Caspase-3引起細胞凋亡[18]。Cyt C自線粒體釋放至細胞漿時，在ATP/dATP的協(xié)助下與兩種重要的凋亡因子結合，分別為：前體凋亡蛋白酶9（procaspase-9）和凋亡蛋白酶活化因子-1（apoptotic protease activating factor-1：Apaf-1）。結合后的三者形成“Cyt C-Apaf-1-procaspase-9多聚體”，又稱之為凋亡復合體（apoptosome）。這種凋亡復合體可以激活并生成caspase9，從而引發(fā)caspase級聯(lián)反應，具體表現(xiàn)為caspase9誘導其他的caspase（主要是caspase3、caspase6、caspase7），這些執(zhí)行者caspase引起細胞皺縮，DNA斷裂并破壞細胞骨架，從而引發(fā)細胞凋亡。本實驗發(fā)現(xiàn)平陽霉素誘導血管瘤內皮細胞凋亡過程中Cyt C表達基因呈高表達。

以上實驗結果表明，平陽霉素誘導人血管瘤內皮細胞凋亡途徑復雜，涉及多種因素，其中有線粒體凋亡相關蛋白：PARP-1及Cyt C參與。平陽霉素為治療血管瘤的常用藥物，可以在體外誘導人血管瘤內皮細胞發(fā)生凋亡，我們在實驗結果中得到血管瘤內皮細胞凋亡過程中有線粒體途徑參與。我們尚不知是否有其他的凋亡途徑參與到血管瘤內皮細胞的凋亡。目前這方面的研究也并不完善，對于差異蛋白組中的未知蛋白的作用未能做深入研究，對這些未知蛋白在凋亡過程中發(fā)揮的作用深入研究，有助于我們深刻理解血管瘤的成因及凋亡機制，可能為血管瘤的治療帶來新的思路。

[參考文獻]

[1]Razon MJ，Kraling BM， Mulliken JB，et al. Increased apoptosis coincides with onset of involution in infantile hemangioma[J]. Microcirculation，1998，5（2-3）：189-195.

[2]Adam-Vizi V， Chinopoulos C. Bioenergetics and the formation of mitochondrial reactive oxygen species[J].Trends Pharmacol Sci，2006，27： 639-645.

[3]Alvarez S，Valdez LB，Zaobornyj T，et al.Oxygen dependence of mitochondrial nitric oxide synthase activity[J]. Biochem Biophys Res Commun，2003，305： 771-775.

[4]Andreyev AY，Kushnareva YE，Starkov AA. Mitochondrial metabolism of reactive oxygen species[J]. Biochemistry （Mosc），2005，70： 200-214.

[5]Saleh A，Srinivasula SM，Acharya S，et al.Cytochrome c and dATP-mediated oligomerization of Apaf-1 is a prerequisite for procaspase-9 activation[J]. Biol Chem，1999， 274： 17941-17945.

[6]Hurd TR，Costa NJ，Dahm CC，et al.Glutathionylation of mitochondrial proteins[J]. Antioxid Redox Signal，2005，7： 999-1010.

[7]Turrens JF. Mitochondrial formation of reactive oxygen species[J]. Physiol，2003，552： 335-344.

[8]Bell EL，Klimova TA，Eisenbart J，et al. The Qo site of the mitochondrial complex III is required for the transduction of hypoxic signaling via reactive oxygen species production[J]. Cell Biol，2007，177： 1029-1036.

[9]Barja G. Mitochondrial oxygen radical generation and leak： sites of production in states 4 and 3，organ specificity， and relation to aging and longevity[J].Bioenerg Biomembr，1999，31： 347-366.

[10]陳超，楊體泉.嬰幼兒血管瘤內皮細胞凋亡的研究進展[J].實用兒科臨床雜雜志，2007，6（22）： 869-870.

[11]李靜巖. Caspase-3與腫瘤關系的研究[J].醫(yī)學綜述，2005，11（5）：430-432.

[12]Hishikawa K， Nakaki T， Fujii T. Connective tissue growth factor induceapop tosisvia to caspase-3 in cultural human cortic smooth muscle cells[J]. Eur J Pharmacol， 2000， 392（1-2）： 19-22.

[13]陳志雄，張瑞蓮，陜聲國，等. Caspase23在皮膚血管瘤不同時期的表達及意義[J]. 中華試驗外科雜志，2004，21（9）： 1109-1110.

[14]Steighner R J， Povirk L F. Bleomycin-induced DNA lesions at mutalional hot spots：Implications for the mechanism of double-strand cleavage[J]. Proc Nall Aced Sci USA，1990，87（21）： 8350-8354.

[15]Cadenas E，Davies KJ.Mitochondrial free radical generation，oxidative stress and aging[J]. Free Radic Biol Med，2000，29：222-230.

[16]Raha S，Robinson BH. Mitochondria oxygen free radicals，disease and ageing[J].Trends Biochem Sci，2000，25： 502-508.

[17]Zielonka J，Srinivasan S，Hardy M，et al.Cytochrome c -mediated oxidation of hydroethidine and mitohydroethidine in mitochondria： identification of homo-and heterodimers[J].Free Radic Biol Med，2008，44：835-846.

[18]Kiechle F L， Zhang X. Apoptosis： biochemical aspects and clinical implications [J].Clin Chim Acta，2002，326（1-2）：27-45.

[收稿日期]2012-08-25 [修回日期]2012-09-16

編輯/張惠娟