戴銘睿,索良東,康濰循,郭麗穎,高 歆,曹英琪,黃興宇,王志強(qiáng),馮程宇,曲 靜,賀小英*

(1.內(nèi)蒙古科技大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,內(nèi)蒙古包頭 014010;2.赤峰市醫(yī)院耳鼻喉科,內(nèi)蒙古赤峰 024000)

動(dòng)物毒理?yè)p傷是指外源因素包括化學(xué)、物理和生物因素等對(duì)動(dòng)物機(jī)體的損害,肝臟與腎臟是哺乳動(dòng)物對(duì)外界有害物響應(yīng)的重要器官。當(dāng)今,尋找科學(xué)有效的手段用于評(píng)價(jià)動(dòng)物毒理?yè)p傷是生物學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域一直以來(lái)研究的熱點(diǎn)。通常,國(guó)際上采用理化分析方法,該方法具有準(zhǔn)確、靈敏和快速的特點(diǎn),在動(dòng)物毒理?yè)p傷的研究過(guò)程中起著重要作用。然而,理化分析存在動(dòng)態(tài)不穩(wěn)定,不太適合動(dòng)物毒理或病理學(xué)的診斷的缺點(diǎn)[1]。近年來(lái),利用分子標(biāo)志物對(duì)動(dòng)物毒理學(xué)和病理學(xué)的研究成為了關(guān)注的焦點(diǎn)。此外,ICR小鼠因?yàn)榕c人的基因具有較高的同源性因此可作為用來(lái)對(duì)人類毒理學(xué)及病理學(xué)進(jìn)行評(píng)估較為理想的模式生物。通過(guò)前期的調(diào)查發(fā)現(xiàn)受污染的地下水會(huì)對(duì)ICR小鼠的肝臟和腎臟功能造成遺傳性損傷[2]。因此,為了進(jìn)行篩選針對(duì)肝、腎損傷的分子標(biāo)志物,本試驗(yàn)構(gòu)建了ICR小鼠毒性損傷的病理學(xué)模型,并對(duì)小鼠肝臟、腎臟樣本進(jìn)行高通量測(cè)序,篩選出顯著上調(diào)基因,繪制基因功能交叉分類韋恩圖,根據(jù)基因功能分類及基因信號(hào)通路富集篩選可作為分子標(biāo)志物的基因,并在細(xì)胞水平上觀察其形態(tài)損傷影響和分子標(biāo)記基因進(jìn)行驗(yàn)證。本研究旨在為有毒有害物對(duì)于生物體肝、腎損傷的診斷和健康評(píng)價(jià)提供一種新思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 4周齡ICR雌性小鼠,購(gòu)于斯貝福(北京)生物技術(shù)有限公司,飼養(yǎng)于內(nèi)蒙古科技大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室,通風(fēng)良好,溫度20～25℃,濕度50%～60%,自由采食。本試驗(yàn)動(dòng)物來(lái)源及使用操作均嚴(yán)格遵循動(dòng)物倫理要求。

1.1.2 主要試劑 75%乙醇,天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司產(chǎn)品;0.9%生理鹽水,山東齊都藥業(yè)有限公司產(chǎn)品;硝酸,北京化學(xué)試劑廠產(chǎn)品。

1.1.3 儀器設(shè)備 二氧化碳培養(yǎng)箱(Galaxy S 型) RS Biotech公司產(chǎn)品;熒光倒置顯微鏡(AE30/31+型),日本尼康株式會(huì)社產(chǎn)品;水浴鍋(Thermo Scientific 型),萊恩德智能科技有限公司產(chǎn)品;分析天平(MP6001型),上海精密科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品;Real-time PCR儀(Thermo Scientific 型),英濰捷基上海貿(mào)易有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 小鼠毒性損傷模型制備 本研究采用的水樣點(diǎn)為北方某地礦區(qū)及尾礦庫(kù),且該地區(qū)已被證實(shí)水質(zhì)受污染[2-3]。根據(jù)礦區(qū)水樣的位置不同,將小鼠分為L(zhǎng)1～L5共5個(gè)組進(jìn)行建模,將尾礦庫(kù)取樣水作用的小鼠分為2組,分別為滲漏水喂養(yǎng)的S組和庫(kù)內(nèi)水喂養(yǎng)的K組,同時(shí)設(shè)置對(duì)照組采用自來(lái)水喂養(yǎng),保持8個(gè)組小鼠飼喂條件相同,適應(yīng)性培養(yǎng)7 d后進(jìn)行每日定時(shí)進(jìn)行灌胃,每只鼠每次0.2 mL,28 d為1個(gè)周期。

1.2.2 采取ICR小鼠肝臟和腎臟 試劑、容器、器械提前4℃預(yù)冷,用頸椎脫臼法處死小鼠后用75%乙醇對(duì)小鼠皮毛進(jìn)行表面消毒,使用剪毛剪打開(kāi)小鼠腹腔后換用新的鑷子和剪刀小心取出肝臟及腎臟,避免污染,使用生理鹽水沖洗血漬將臟器置于一次性無(wú)菌培養(yǎng)皿中,保存4℃用于后續(xù)研究。

1.2.3 高通量測(cè)序 所需基因文庫(kù)構(gòu)建結(jié)束后,使用PCR擴(kuò)增技術(shù)對(duì)基因文庫(kù)片段進(jìn)行富集,根據(jù)片段大小進(jìn)行文庫(kù)選擇,控制文庫(kù)大小在450 bp。進(jìn)行質(zhì)檢后,對(duì)文庫(kù)總濃度及有效濃度進(jìn)行檢測(cè),然后將文庫(kù)進(jìn)行混合。

樣品經(jīng)過(guò)RNA抽提、純化、建庫(kù)之后,采用二代測(cè)序技術(shù)(NGS),基于Illumina測(cè)序平臺(tái),對(duì)這些文庫(kù)進(jìn)行雙末端(paired-end,PE)測(cè)序。

2 結(jié)果

2.1 對(duì)肝臟的高通量的測(cè)序分析

小鼠經(jīng)北方某礦區(qū)滲漏水28 d灌胃后處死,采取其肝臟組織提取總RNA進(jìn)行高通量測(cè)序,將得到的數(shù)據(jù)進(jìn)行分類整理,篩選出pval<0.001的基因進(jìn)行進(jìn)一步分析得到基因表達(dá)差異火山圖(圖1)。

橫縱坐標(biāo)分別表示試驗(yàn)組(Case)和對(duì)照組(ctrl)生物學(xué)重復(fù)差異倍數(shù)FC值的對(duì)數(shù)值。根據(jù)基因表達(dá)差異倍數(shù)FC值的篩選,紅色圓點(diǎn)表示顯著的上調(diào)基因,綠色圓點(diǎn)表示顯著下調(diào)的基因,灰色圓點(diǎn)表示差異不顯著的基因。

L1與ctrl中差異基因共14個(gè),其中呈現(xiàn)上調(diào)的差異基因共9個(gè),呈現(xiàn)下調(diào)的基因有5個(gè)。L1與L5中下調(diào)較為顯著差異基因有20個(gè),上調(diào)顯著差異基因35個(gè)。L5與ctrl下調(diào)顯著差異基因有40個(gè),上調(diào)顯著差異基因有22個(gè)。

通過(guò)得到的數(shù)據(jù)可知,經(jīng)過(guò)礦區(qū)不同位置水樣灌胃的小鼠其肝臟器官部分基因表達(dá)出現(xiàn)了差異,現(xiàn)對(duì)其差異基因進(jìn)行Venn圖處理(圖片未顯示)。以a1為L(zhǎng)1組和ctrl的差異基因,b1為L(zhǎng)5組與ctrl的差異基因,c1為L(zhǎng)1組和L5組的差異基因,d1為L(zhǎng)3和L5組的差異基因。其中a1與b1兩組相同差異基因有4個(gè),a1與c1兩組相同差異基因有4個(gè),b1與c1與兩組相同差異基因有23個(gè),b1組、c1組和d1組3組相同差異基因有2個(gè)。

2.2 對(duì)腎臟的高通量的測(cè)序分析

通過(guò)高通量測(cè)序了解到了礦區(qū)水樣對(duì)小鼠腎臟的基因表達(dá)影響情況火山圖如下。

礦區(qū)L1取樣點(diǎn)樣水與內(nèi)蒙古科技大學(xué)自來(lái)水對(duì)小鼠進(jìn)行灌胃28 d,后小鼠腎臟器官出現(xiàn)的基因表達(dá)差異如圖2所示。其中下調(diào)顯著差異基因有19個(gè),上調(diào)顯著差異基因有11個(gè)。L1取樣點(diǎn)樣水與L5取樣點(diǎn)水對(duì)小鼠其中下調(diào)顯著差異基因有9個(gè),上調(diào)顯著差異基因有16個(gè)。L3與ctrl其中下調(diào)顯著差異基因有9個(gè),上調(diào)顯著差異基因有16個(gè)。L3與L5 出現(xiàn)的基因表達(dá)差異中下調(diào)顯著差異基因有2個(gè),上調(diào)顯著差異基因3個(gè)。L5組與ctrl中下調(diào)顯著差異基因有11個(gè),上調(diào)顯著差異基因有1個(gè)。

A.L1與ctrl ;B.L1與L5; C.L3與ctrl; D.L3與L5; E.L5與ctrl

對(duì)差異基因進(jìn)行進(jìn)一步分析,將所得部分差異基因進(jìn)行韋恩圖繪制。

a2集合為L(zhǎng)1組與對(duì)照組的差異基因,b2集合為L(zhǎng)3與對(duì)照組的差異基因,c2集合為Y5與對(duì)照組的差異基因,d2組為L(zhǎng)3與L5的差異基因,e2組為L(zhǎng)1與L5的差異基因。其中a2與b2相同差異基因有2個(gè),a2與c2兩交集有1個(gè)差異基因,a2與e2相同差異基因有5個(gè),b2與c2相同差異基因有1個(gè),b2與d2相同差異基因有1個(gè),c2與d2相同差異基因有1個(gè),c2與e2相同差異基因有12個(gè),a2集合b2集合與e2集合相同差異基因有1個(gè),a2集合b2集合d2集合與e2集合相同差異基因有1個(gè)。

2.3 某尾礦庫(kù)水對(duì)生物體的影響

2.3.1 對(duì)肝臟的高通量的測(cè)序分析 使用庫(kù)內(nèi)水與內(nèi)蒙古科技大學(xué)自來(lái)水對(duì)小鼠灌胃28d后小鼠肝臟器官出現(xiàn)的基因表達(dá)差異如圖3所示。

A.庫(kù)內(nèi)水組與ctrl; B.庫(kù)內(nèi)水組與滲漏水組; C.滲漏水組與ctrl

其中下調(diào)顯著差異基因有36個(gè),上調(diào)顯著差異基因有55個(gè)。庫(kù)內(nèi)水組與滲漏水組差異基因中下調(diào)顯著差異基因有31個(gè),上調(diào)顯著差異基因有18個(gè)。滲漏水與對(duì)照組差異基因中下調(diào)顯著差異基因有90個(gè),上調(diào)顯著差異基因有102個(gè)。

篩選數(shù)據(jù)繪制肝臟差異基因韋恩圖,a3為庫(kù)內(nèi)水與ctrl差異基因,b3組為滲漏水與ctrl部分差異基因,c3組為滲漏水與庫(kù)內(nèi)水的部分差異基因。其中a3組與b3組相同差異基因有16個(gè),b3組與c3組差異基因有15個(gè)。

2.3.2 對(duì)腎臟的高通量的測(cè)序分析 分別取得庫(kù)內(nèi)水以及滲漏水對(duì)小鼠灌胃28 d后對(duì)小鼠腎臟器官樣本進(jìn)行高通量測(cè)序分析,分析結(jié)果如下。

其中下調(diào)顯著差異基因32個(gè),上調(diào)顯著差異基因52個(gè)。庫(kù)內(nèi)水與滲漏水組間下調(diào)顯著差異基因23個(gè),上調(diào)顯著差異基因12個(gè)。庫(kù)內(nèi)水與自來(lái)水對(duì)照組間下調(diào)顯著差異基因9個(gè),上調(diào)顯著差異基因21個(gè)。

篩選處理數(shù)據(jù)后繪制部分腎臟差異基因韋恩圖處理后得(圖4)。a4組為庫(kù)內(nèi)水與對(duì)照組差異基因,b4組為滲漏水與對(duì)照組部分差異基因,c4組為滲漏水與庫(kù)內(nèi)水部分差異基因。a4組與b4組相同差異基因有27個(gè),b4組與c4組差異基因有47個(gè),a4,b4,c4 3個(gè)組相同差異基因共3個(gè)。

A.滲漏水組與ctrl; B.庫(kù)內(nèi)水組與滲漏水組; C.庫(kù)內(nèi)水組與ctrl

2.4 受污染水源對(duì)肝臟與腎臟的影響

通過(guò)以上試驗(yàn)數(shù)據(jù)分析整理,我們可得知不同礦區(qū)水源,不同水源位置,對(duì)小鼠肝臟以及腎臟造成不同影響。在各個(gè)小組對(duì)比中我們可以看出,來(lái)源不同礦區(qū)水樣對(duì)小鼠灌胃處理后小鼠的腎臟肝臟影響導(dǎo)致不同差異表達(dá)基因。如果想要進(jìn)一步發(fā)掘環(huán)境污染早期篩選及生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)分子標(biāo)志物,我們需要進(jìn)一步縮小差異基因范圍。本試驗(yàn)對(duì)不同水源地肝臟和腎臟器官差異表達(dá)基因進(jìn)行進(jìn)一步分析。

a5代表尾礦庫(kù)樣水對(duì)小鼠肝臟器官影響下差異表達(dá)基因,b5代表北方某礦區(qū)樣水對(duì)小鼠肝臟器官產(chǎn)生的差異表達(dá)基因,其中兩集合交集基因共23個(gè),每個(gè)基因在本試驗(yàn)每個(gè)小鼠體內(nèi)都有相同的調(diào)控方向。a6代表礦區(qū)樣水對(duì)小鼠腎臟器官差異表達(dá)基因,b6代表尾礦庫(kù)樣水對(duì)小鼠腎臟器官差異表達(dá)基因,其中兩集合交集基因共25個(gè),且每個(gè)基因在本試驗(yàn)的每個(gè)小鼠體內(nèi)都具有相同的調(diào)控方向。

2.5 體外培養(yǎng)細(xì)胞系毒理學(xué)形態(tài)觀察

使用具有主要影響作用的重金屬離子與鹽離子摸索最適損傷濃度對(duì)體外培養(yǎng)的NRK細(xì)胞進(jìn)行脅迫作用,其Mn2+濃度為900 μmol/mL、Zn+濃度為570 μmol/mL、F-濃度為15 mmol/mL、Cl-濃度為150 mmol/mL對(duì)細(xì)胞形態(tài)以及數(shù)量具有顯著影響。

3 討論

生物體可以通過(guò)不同的途徑接觸到有毒有害物造成不同程度的肝腎損傷,比如飲用受污染的水、呼吸道傳播、給藥等。經(jīng)調(diào)查發(fā)現(xiàn),在內(nèi)蒙古東部某醫(yī)院2013年至今,凡從事礦區(qū)或冶煉工作的人群,通過(guò)耳鼻喉長(zhǎng)期接觸污染源,最終會(huì)合并嚴(yán)重肝腎損傷病例(數(shù)據(jù)未顯示)。因此,尋找有毒有害污染的分子標(biāo)志物對(duì)動(dòng)物乃至人類肝腎疾病的診斷治療具有重要意義。

本試驗(yàn)通過(guò)研究小鼠肝臟和腎臟基因表達(dá)差異現(xiàn)象,并對(duì)不同水樣灌胃小鼠肝臟和腎臟差異表達(dá)基因數(shù)據(jù)進(jìn)行篩選分析。得到了不同組別中相同差異表達(dá)基因。這些基因?qū)Πl(fā)現(xiàn)和探尋環(huán)境污染早期診斷以及生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估分子標(biāo)志物提供了理論基礎(chǔ)。通過(guò)分析北方某礦區(qū)與尾礦庫(kù)樣水對(duì)小鼠肝臟基因的差異表達(dá)數(shù)據(jù)得到了顯著差異基因23個(gè)以及腎臟顯著差異基因25個(gè)。針對(duì)這些顯著差異基因進(jìn)行檢索查閱,這些基因按功能分類如表1所示。

表1 差異基因功能分類表

這些基因主要富集在小鼠的免疫、基因表達(dá)調(diào)控、代謝、癌變、凋亡等方面有主要影響。其中Chordc1基因與Cry1基因在兩個(gè)礦區(qū)小鼠肝臟和腎臟差異表達(dá)基因中均有高表達(dá)出現(xiàn),因此可以初步推斷Chordc1基因與Cry1基因具有作為分子標(biāo)志物的研究?jī)r(jià)值,其中Chordc1基因可調(diào)節(jié)中心體復(fù)制,也可以抑制ROCK2的激酶活性,對(duì)肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架重塑也有一定的調(diào)控作用,同時(shí)參與了哺乳動(dòng)物大腦的晝夜節(jié)律與穩(wěn)態(tài)機(jī)制[3]。Cry1基因可參與構(gòu)成生物鐘核心成分的轉(zhuǎn)錄抑制因子,在肝臟中對(duì)維持全身葡萄糖穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要[4]。該基因可通過(guò)與膜偶聯(lián)G蛋白結(jié)合并阻斷胰高血糖素介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)cAMP濃度增加和CREB1磷酸化,介導(dǎo)cAMP信號(hào)傳導(dǎo)和糖異生的晝夜節(jié)律調(diào)節(jié)[5]。也可以通過(guò)降低下調(diào)糖異生基因表達(dá)的核FoxO1水平來(lái)抑制肝糖異生[6]。在調(diào)節(jié)細(xì)胞周期和代謝方面有一定的作用[7]。

分子標(biāo)志物在醫(yī)療診斷、動(dòng)物毒理及環(huán)境污染等領(lǐng)域的貢獻(xiàn)已經(jīng)逐漸顯現(xiàn)出來(lái),更為準(zhǔn)確、快速、高效的分子標(biāo)志物將逐漸被各個(gè)領(lǐng)域發(fā)現(xiàn)并應(yīng)用。本試驗(yàn)所得的小鼠體內(nèi)Chordc1基因與Cry1基因?qū)τ谖驳V地區(qū)環(huán)境污染診斷問(wèn)題有較重要的實(shí)際意義,可以通過(guò)對(duì)Chordc1基因在免疫系統(tǒng)中所參與的調(diào)控方式進(jìn)行研究[8],探明小鼠體內(nèi)出現(xiàn)的較為顯著的生理指標(biāo),建立與環(huán)境污染程度匹配的參考體系,從而準(zhǔn)確快速靈敏的做到環(huán)境污染早期檢測(cè)與生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估功能。對(duì)于Cry1基因注重其代謝方向產(chǎn)生影響,現(xiàn)有研究表明其與重度抑郁癥,失眠和焦慮[9],晝夜節(jié)律有較為密切的關(guān)聯(lián)[10]?？梢葬槍?duì)Chordc1基因與Cry1基因展開(kāi)更為深層次研究,例如通過(guò)對(duì)Chordc1基因與Cry1基因的表達(dá)過(guò)程,下游分子通路探究及功能回復(fù)驗(yàn)證進(jìn)行研究,可進(jìn)一步提高該基因的分子標(biāo)志物準(zhǔn)確性。對(duì)該基因進(jìn)行Spring分析,篩選下游潛在靶標(biāo)互作分子,采用敲低質(zhì)粒敲低該基因,qPCR檢測(cè)靶標(biāo)分子表達(dá)量判斷是否與其GEO數(shù)據(jù)庫(kù)的生物信息學(xué)分析變化趨勢(shì)一致,可選取變化最顯著的靶標(biāo)分子作為研究目標(biāo)進(jìn)一步探尋與蛋白的互作模式。