劉麗　顏世翠　姚良同　丁延芹　杜秉海

摘 要：根結(jié)線蟲病在世界范圍內(nèi)對糧食蔬菜水果產(chǎn)量影響嚴(yán)重，其人工培養(yǎng)具有依賴寄主植物的局限性。從山東省泰安市房村鎮(zhèn)的日光溫室中采集被根結(jié)線蟲侵染嚴(yán)重的番茄根系，用機(jī)械搗碎-過篩噴淋法從根系樣品中分離根結(jié)線蟲和卵，以牡丹根腐病鐮刀菌（Fusarium solani）制作二重培養(yǎng)基，分別接種根結(jié)線蟲懸液與卵懸液培養(yǎng)。結(jié)果顯示，接種線蟲懸液與卵懸液的平板分別在第三周與第四周線蟲密度達(dá)到最高峰，培養(yǎng)基中蟲口密度分別為2 300頭/ml與2 000頭/ml。置培養(yǎng)平板于15℃條件下存放，5個月后培養(yǎng)基內(nèi)仍有可供繼代繁殖的活蟲體。該優(yōu)化后的方法脫離了寄主植物束縛，簡化了培養(yǎng)過程，具有高效繁殖和長期保存根結(jié)線蟲的優(yōu)點。

關(guān)鍵詞：根結(jié)線蟲；人工培養(yǎng)；牡丹根腐病鐮刀菌；優(yōu)化方法

中圖分類號：S436.412.2+9 文獻(xiàn)標(biāo)識號：A 文章編號：1001-4942（2012）11-0117-04

An Optimized Artificial Culture and Preservation Method

for Tomato Root-knot Nematodes

Liu Li， Yan ShiCui， Yao LiangTong， Ding YanQin， Du BingHai*

（College of Life Science， Shandong Agricultural University /Shandong Key Laboratory of

Agricultural Microbiology， Taian 271018， China）

Abstract Root-knot nematodes seriously decreased the production of crops， fruits and vegetables worldwide， and its artificial culture relied heavily on host plants. In this study， the tomato roots infected by root-knot nematodes were adopted from greenhouse of Fangcun Town， Taian City， Shandong Province， and the root-knot nematodes and eggs were separated by the method of mechanical beating-sifting spray and inoculated to double medium of Fusarium solani. The density of root-knot nematodes was about 2 300 per mini liter medium when inoculated with root-knot nematodes for three weeks and about 2 000 when inoculated with eggs for four weeks. Live root-knot nematodes could still be obtained after 5 months， if the culture plate was preserved at 15℃. This optimized method was independent of host plants， processed more simply， could obtain large quantity of root-knot nematodes in short time and preserve for long time.

Key words Root-knot nematode； Artificial culture； Fusarium solani； Optimized method

根結(jié)線蟲（Meloidogyne spp）是一類廣泛分布在世界各地的植物根系定居性內(nèi)寄生線蟲[1]。根結(jié)線蟲屬寄主范圍廣泛，可侵染的植物超過3 000種，分屬114科，如蔬菜、糧食作物、經(jīng)濟(jì)作物和果樹、觀賞植物以及雜草都可被侵染[2，3]。根結(jié)線蟲一旦發(fā)生，很難徹底清除，連作期愈長發(fā)病愈重。在溫帶、亞熱帶、熱帶地區(qū)的植物受害比其他地區(qū)更為嚴(yán)重，病害可造成作物減產(chǎn)10%～20%，嚴(yán)重時可達(dá)75%以上，還能傳播一些真菌和細(xì)菌性病害[4，5]。

目前關(guān)于根結(jié)線蟲的分類、生物防治、基因組研究已比較深入，而其培養(yǎng)和保存的研究相對較少。一直以來，對于根結(jié)線蟲的培養(yǎng)多利用活體寄主植物如盆栽番茄、擬南芥、辣椒、馬鈴薯、空心菜等，或者是寄主植物的組織培養(yǎng)離體苗和根段外植體的方式，具有作業(yè)量大、過程繁瑣、耗時長的缺點[1]。鮑時翔等（2009）[1]發(fā)明了一種利用香蕉枯萎病鐮刀菌（Fusarium oxysporum fsp cubense）培養(yǎng)和繁殖根結(jié)線蟲的方法，解決了根結(jié)線蟲的培養(yǎng)依賴寄主植物的問題，但該培養(yǎng)方法存在供試菌種單一、操作過程非常繁瑣復(fù)雜的缺陷。本研究小組在其基礎(chǔ)上進(jìn)行優(yōu)化和改進(jìn)，簡化培養(yǎng)過程，優(yōu)化操作方法，發(fā)現(xiàn)了另一種可用于根結(jié)線蟲人工培養(yǎng)的鐮刀菌——牡丹根腐病鐮刀菌（Fusarium solani），用其制作二重培養(yǎng)基接種根結(jié)線蟲懸液或卵懸液，培養(yǎng)出大批量根結(jié)線蟲。該方法脫離了寄主植物束縛，操作更為簡便，具有高效繁殖和長期保存根結(jié)線蟲的優(yōu)點。

1 材料與方法

11 供試材料

從根結(jié)線蟲發(fā)病較為嚴(yán)重的山東省泰安市房村鎮(zhèn)的日光溫室中采集根結(jié)線蟲侵染嚴(yán)重的番茄植株的根系樣品，分離根結(jié)線蟲和卵。用于番茄根結(jié)線蟲培養(yǎng)的供試菌種為牡丹根腐病鐮刀菌，由山東省農(nóng)業(yè)微生物學(xué)重點實驗室提供。

12 番茄根結(jié)線蟲的分離

采用機(jī)械搗碎—過篩噴淋法。用清水洗凈番茄根結(jié)樣品，用剪刀將發(fā)病重、根結(jié)多的根系剪成長約1 cm的小段，放入組織搗碎均漿機(jī)中，加適量水搗碎5～10 min，形成線蟲與根組織碎片的混合物。將混合物倒入裝有10% NaClO溶液的三角瓶中，使溶液沒過根系，搖晃三角瓶3 min[6]。再將混合物倒入組合篩上，組合篩自上而下依次為40目、200目、325目和500目。用噴壺形成薄霧噴灑40目篩上的混合物約05 h，使線蟲和卵從根組織內(nèi)移到表面，被噴霧水沖洗至組合篩的底部。注意調(diào)節(jié)好水的流量，以免水溢出使線蟲流失[7]，噴淋后期使用無菌水。噴淋過后，取出組合篩中的325目篩，用無菌水自篩的一側(cè)向另一側(cè)噴淋沖洗，使線蟲集中到篩的一側(cè)，然后再用少量無菌水從篩的背面沖洗篩上物，收集液體到容器中，獲得根結(jié)線蟲懸液，并配成200條/ml的濃度。用同法沖洗500目篩，可制備卵懸液。

13 番茄根結(jié)線蟲的人工培養(yǎng)方法

131 鐮刀菌菌種的活化 從斜面保藏的牡丹根腐病鐮刀菌菌種中挑取一小塊接種到PDA培養(yǎng)基中活化，在28℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3～5 d。

132 鐮刀菌種子液的制作 從活化好的真菌中挑取1個菌塊接種在容積為100 ml內(nèi)裝50 ml液體PDA培養(yǎng)基的三角瓶中，于轉(zhuǎn)速180 r/min、溫度28℃條件下培養(yǎng)2 d即可獲得真菌的種子培養(yǎng)液。

133 二重培養(yǎng)基的制備 將獲取的真菌種子培養(yǎng)液以每板01 ml的量均勻涂布至固體PDA培養(yǎng)基中，在28℃的培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)2 d左右，待整個培養(yǎng)皿長滿菌絲后即為二重培養(yǎng)基。用于制作二重培養(yǎng)基的PDA平板要適當(dāng)增厚，以延長根結(jié)線蟲的培養(yǎng)時間。

134 根結(jié)線蟲懸液的制備 見本文“12”番茄根結(jié)線蟲的分離（采用機(jī)械搗碎-過篩噴淋法）。

135 根結(jié)線蟲的接種與培養(yǎng) 無菌條件下，將制備好的根結(jié)線蟲懸液05 ml（約100條）或卵懸液05 ml（約100個），接至二重培養(yǎng)基圓心處，合蓋靜置1～2 h使液滴浸沉，用膜封口，在28℃培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)[1]。

從第二周開始，在根結(jié)線蟲培養(yǎng)平板上菌絲消失區(qū)域均勻取樣，用樣品中的線蟲數(shù)估算每毫升培養(yǎng)基中的線蟲數(shù)。具體方法為：用半徑為35 mm的打孔器，打孔取培養(yǎng)基樣品至24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔2塊培養(yǎng)基樣品、1 ml無菌水，攪拌均勻。每孔取40 μl混合液至96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，在倒置顯微鏡下計數(shù)，每孔重復(fù)3次觀察計數(shù)，計算24孔細(xì)胞培養(yǎng)板每孔中線蟲蟲體數(shù)目，然后估算每毫升培養(yǎng)基中的線蟲數(shù)，統(tǒng)計3個線蟲培養(yǎng)平板，每周測1次，直至第9周。

136 培養(yǎng)線蟲的存放 對于已經(jīng)進(jìn)入繁殖高峰期的根結(jié)線蟲培養(yǎng)平板，要轉(zhuǎn)入冷涼條件下存放，可置15℃培養(yǎng)箱內(nèi)[8]。

14 從培養(yǎng)平板獲取根結(jié)線蟲懸液或卵懸液

無菌條件下，在根結(jié)線蟲培養(yǎng)平板上取適量培養(yǎng)基于容積為100 ml內(nèi)裝40 ml無菌水的三角瓶中，封口，于180 r/min搖床上振蕩培養(yǎng)10 min，使線蟲與水充分混合。在搖好的混合液中加入10% NaClO溶液21 ml，使混合液中NaClO濃度為05%，搖晃3 min[9]。然后將混合液倒入組合篩上。用本文12 中過篩噴淋的方法獲取根結(jié)線蟲懸液或卵懸液，并配置成所需濃度。

15 從培養(yǎng)平板獲取根結(jié)線蟲二齡幼蟲懸液

根結(jié)線蟲卵孵化的二齡幼蟲是在整個線蟲生活周期中對寄主植物根系具有侵染力的階段，因此獲取根結(jié)線蟲二齡幼蟲懸液具有重要意義。具體方法為：將根結(jié)線蟲培養(yǎng)平板置于倒置顯微鏡下，用解剖針挑取其中的卵粒，置于200目網(wǎng)篩里，先將網(wǎng)篩置于05% NaClO溶液中搖晃3 min，然后置清水中1 min，并沖洗3次，再將網(wǎng)篩置培養(yǎng)皿中并使皿中的清水剛好沒過篩底的卵粒，置28℃培養(yǎng)箱中孵化，每隔24 h收集皿內(nèi)的二齡幼蟲[9，10]，收集3次，將收集的線蟲二齡幼蟲懸液配至所需濃度，置4℃?zhèn)溆谩?/p>

16 線蟲傳代培養(yǎng)方法

為了獲得持續(xù)和穩(wěn)定的根結(jié)線蟲源，需要對進(jìn)入蟲體繁殖密度低谷期的根結(jié)線蟲培養(yǎng)平板進(jìn)行換板傳代。用本文“14”中的方法獲取根結(jié)線蟲懸液或卵懸液，然后用“13”中的方法，將懸液接種于二重培養(yǎng)基中，可繼續(xù)培養(yǎng)根結(jié)線蟲。

2 結(jié)果與分析

21 番茄根結(jié)線蟲培養(yǎng)平板的變化及分析

用牡丹根腐病鐮刀菌制作二重培養(yǎng)基培養(yǎng)根結(jié)線蟲過程中發(fā)現(xiàn)，接種根結(jié)線蟲懸液的平板，一周后中央接種處的菌絲開始消退，消退圈逐漸向四周延伸；培養(yǎng)兩周時平板如圖1所示；培養(yǎng)二周半時平板菌絲即完全消失，剩下黃褐色局部暗褐色的潮濕裸露的培養(yǎng)基，而且此時培養(yǎng)基具有軟度大、較松散、難以用鑷子夾取等特點。對于接種卵懸液的平板，試驗結(jié)果與接種線蟲懸液的平板相似，只是中央菌絲消失時間要比接種線蟲懸液的平板晚，兩周時菌絲開始消退，三周半左右才可消失完全。

圖1 接種根結(jié)線蟲懸液二周時的線蟲培養(yǎng)平板圖片

由平板變化現(xiàn)象可知，接種線蟲懸液后，線蟲需要一段時間來適應(yīng)平板環(huán)境，然后才開始取食菌絲。而接種卵懸液的平板菌絲消失時間要比接種線蟲懸液的平板晚，這是由于卵適應(yīng)平板環(huán)境后還需要先孵化成二齡幼蟲，然后再取食菌絲所致。

22 根結(jié)線蟲的密度變化

由圖2可知，在接種線蟲懸液的平板內(nèi)，根結(jié)線蟲不斷繁殖，到第三周線蟲密度達(dá)到最高峰，約為2 300頭/ml培養(yǎng)基，然后隨著時間的延長，平板內(nèi)菌絲減少，空間擁擠，代謝廢物增加，使根結(jié)線蟲生存條件下降，線蟲蟲口密度不斷降低，到第九周時，線蟲密度約為120頭/ml培養(yǎng)基，僅為高峰期的5%。接種卵懸液的平板，在第四周蟲口密度達(dá)到最高峰，約為2 000頭/ml培養(yǎng)基，第九周時，蟲口密度約為240頭/ml培養(yǎng)基，為高峰期的12%。從線蟲密度總變化趨勢來看，在第六周進(jìn)行根結(jié)線蟲換板傳代培養(yǎng)最適宜。第四周到第九周，蟲體密度變化趨勢在局部（接種線蟲懸液的平板在第七周，接種卵懸液的平板在第五周）呈不正常凹陷，可能是因為平板內(nèi)部分區(qū)域線蟲蟲體密度不均所致，但不影響蟲口密度變化總趨勢。將牡丹根腐病鐮刀菌菌絲完全消退后的根結(jié)線蟲培養(yǎng)平板轉(zhuǎn)入15℃條件下存放，5個月后培養(yǎng)基內(nèi)仍有可供繼代繁殖的活蟲體。

圖2 平板在接種線蟲或卵后不同時期

線蟲密度數(shù)量統(tǒng)計3 結(jié)論與討論

根結(jié)線蟲的分類研究已十分深入，生防研究也已在世界各國廣泛開展，而關(guān)于根結(jié)線蟲培養(yǎng)保存的研究卻相對較少[1]。國外一些學(xué)者將根結(jié)線蟲在離體擬南芥和番茄上進(jìn)行繁殖[11，12]，但試驗條件要求高，要在嚴(yán)格無菌條件下。Barker等人介紹的根結(jié)線蟲繁殖方法，設(shè)備和程序復(fù)雜，不易應(yīng)用[13]。王汝賢等（1999）[13]在Lambert等（1992）水培法[14]的基礎(chǔ)上簡化改進(jìn)，形成根結(jié)線蟲的一種水培繁殖方法。吳慶麗等（2006）[15，16]在比較根結(jié)線蟲在番茄和馬鈴薯上培養(yǎng)效果的基礎(chǔ)上，研究了不同馬鈴薯品種對根結(jié)線蟲的培養(yǎng)效果，并對其光照條件進(jìn)行了研究。焦春偉等（2012）[17]利用空心菜適應(yīng)性強(qiáng)且在沙培澆灌營養(yǎng)液條件下生長周期長、易管理的特點，用其培養(yǎng)爪哇根結(jié)線蟲和花生根結(jié)線蟲取得較好效果。目前國內(nèi)外根結(jié)線蟲的人工培養(yǎng)主要還是依靠盆栽番茄、擬南芥、辣椒、馬鈴薯、空心菜或其他寄主植物，存在作業(yè)量大、周期長、寄主對環(huán)境條件的適應(yīng)性差、過程繁瑣或不易管理等問題[16]。鮑時翔等（2009）[1]用香蕉枯萎病鐮刀菌培養(yǎng)植物根結(jié)線蟲取得較好效果，但其方法存在供試菌種單一，操作過程非常繁瑣復(fù)雜的缺陷。

本試驗在鮑時翔方法的基礎(chǔ)上對其培養(yǎng)方法進(jìn)行優(yōu)化和改進(jìn)，簡化培養(yǎng)過程，優(yōu)化操作方法，發(fā)現(xiàn)了一種可用于根結(jié)線蟲培養(yǎng)的新鐮刀菌——牡丹根腐病鐮刀菌，解決了根結(jié)線蟲培養(yǎng)長期依賴寄主植物和培養(yǎng)過程繁瑣的問題，具有脫離寄主植物束縛、操作簡便、高效繁殖和長期保存根結(jié)線蟲的優(yōu)點。該方法培養(yǎng)的根結(jié)線蟲活性不變，其二齡幼蟲對番茄幼苗依然具有侵染活性，其制備的根結(jié)線蟲二齡幼蟲懸液和卵懸液，可在許多研究如植株的抗線蟲性[18]、根結(jié)線蟲病害的生物防治、線蟲的分類鑒定、基因組學(xué)研究等工作中使用，為根結(jié)線蟲的進(jìn)一步研究提供了便利。參 考 文 獻(xiàn)：

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