富新年，師尚禮，王 贊，李 俊，閆洪唯

（1.甘肅農(nóng)業(yè)大學 草業(yè)學院/草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)教育部重點實驗室/甘肅省草業(yè)工程實驗室/中－美草地畜牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展研究中心，甘肅 蘭州730070；2.中國農(nóng)業(yè)科學院 北京畜牧獸醫(yī)研究所，北京100193）

百脈根（Lotus corniculatus）又名牛角花，是豆科百脈根屬多年生草本植物，原產(chǎn)于歐亞溫暖地區(qū)，目前，在世界各地廣泛種植，具有優(yōu)質(zhì)、高產(chǎn)、抗逆性強、適口性好等特點，是一種優(yōu)良牧草［1］。我國華南、西南、西北、華北等地均有分布，是溫暖濕潤地區(qū)極具潛力的牧草之一［2，3］。百脈根具有重要的經(jīng)濟、生態(tài)和社會效益，研究和開發(fā)百脈根屬植物的種質(zhì)資源具有十分重要的意義。目前，對百脈根種質(zhì)資源遺傳多樣性的研究主要集中在形態(tài)學［4，5］、細胞學［6－8］以及基因工程方面的應用［9］，側(cè)重于百脈根屬植物ISSR（Intersimple Sequence Repeats）分子標記的研究報道較少。因此，本試驗旨在研究ISSR－PCR反應中各參數(shù)變化對實驗結果的影響，并對反應體系進行優(yōu)化，建立適于百脈根的ISSR反應體系，為進一步研究百脈根種群遺傳多樣性奠定基礎。

ISSR標記是基于SSR標記技術開發(fā)出來，它避免了SSR標記開發(fā)難的缺點，是Zietkiewicz等［10］在1994年創(chuàng)立?；谡婧松锘蚪M中含有大量的簡單重復序列，利用單一的通用引物擴增基因組DNA，進而檢測2個微衛(wèi)星間DNA片段的多樣性。其基本原理是在微衛(wèi)星序列的一端加錨1～4個隨意堿基，以此進行引物設計，PCR擴增引物兩端一段反向排列的SSR序列，通過瓊脂糖電泳和溴化乙錠染色，根據(jù)條帶的位置和有無，進行多態(tài)性分析。憑借其穩(wěn)定性強、多態(tài)性高、節(jié)約時間、財力和物力等優(yōu)點，現(xiàn)已是廣泛應用于牧草的分子標記技術之一［11，12］。

1 材料和方法

1.1 材料

選取15份來自俄羅斯的百脈根種質(zhì)為實驗材料。供試的種質(zhì)材料均由中國農(nóng)業(yè)科學院北京畜牧獸醫(yī)研究所提供，于2010年10月育苗，12月采樣。

1.2 基因組DNA的提取與檢測

采用改進的CTAB法［13］，從采集的百脈根葉片中提取DNA。用1%的瓊脂糖凝膠對DNA質(zhì)量進行檢測，用1×TE緩沖液稀釋DNA原液至50ng/mL，－20℃保存以備后用。

1.3 ISSR擴增反應

實驗選取BUC811號為固定引物，其序列為GAGAGAGAGAGAGAGAC，由華大基因科技股份有限公司合成，Taq polymerase、dNTP、Mg2＋緩沖液均來源于TIANGEN公司。

PCR擴增程序為：94℃預變性4min；94℃變性45s，52℃復性60s，72℃延伸1min，共35個循環(huán)；72℃延伸7min，4℃保存。

1.4 正交表的設計

采用正交設計L16（45）在4個水平上進行實驗，對實驗結果進行直觀分析（表1，2）。根據(jù)每個組合產(chǎn)生條帶的豐富度、清晰度，對PCR擴增結果進行打分。最高計為10分，最低計為1分。根據(jù)分數(shù)的不同，求出每因素同一水平下的實驗值之和Ki以及平均值ki，并求得同一因素不同水平間平均值的極差R，從而得出百脈根ISSR－PCR反應各因素的最佳處理。

表1 ISSR－PCR反應的因素與水平Table 1 Factor－levels in ISSR－PCR reaction

表2 ISSR－PCR正交試驗設計方案Table 2 Orthogonal design in ISSR－PCR

1.5 退火溫度、循環(huán)次數(shù)篩選以及體系穩(wěn)定性檢測

根據(jù)正交實驗結果，選擇最優(yōu)的反應體系對退火溫度和循環(huán)次數(shù)進行梯度實驗，以Tm值為基準，上下浮動3℃，依次為47℃、50℃、53℃、56℃，循環(huán)次數(shù)設為30次、35次和40次。隨機選取2個引物用此體系對不同模板DNA進行PCR擴增，然后用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，驗證所得最佳反應體系的可靠性和穩(wěn)定性。

2 結果與分析

2.1 正交實驗結果及直觀分析

正交實驗PCR產(chǎn)物電泳16個組合的分數(shù)依次為8，8，4，1，3，9，6，6，7，7，3，7，8，7，9，8（圖 1）。極差 R反應影響因素對反應體系的影響，R值越大，影響越顯著。影響百脈根PCR反應的因素從大到小依次為：Mg2＋＞TaqDNA聚合酶＞dNTPs＞引物＞模板DNA；單個因素的最佳反應水平分別為：TapDNA聚合酶為第2水平，Mg2＋為第3水平，模板DNA為第2水平，dNTPs為第3水平，引物為第3水平。即理論最適反應水平組合為TaqDNA聚合酶1U＋0.15 mmol·L－1dNTP＋1.5mmol/L Mg2＋＋20ng模板DNA＋0.75μmol/L。但這一組合在正交表中并沒有出現(xiàn)，與分值最高的6號組合比較接近，僅dNTP和引物的用量不同。ISSR－PCR反應體系中，各個因素的變化都會造成擴增結果的不同，通過對優(yōu)化方案的分析，從實驗效果以及經(jīng)濟上來綜合考慮，最終確立的20μL百脈根ISSR－PCR的反應體系為：40ng模板DNA、2μL 10×PCR Buffer、0.15mmol·L－1dNTP、0.75μmol/L ISSR 引 物、1.5mmol/L MgCl2、1U TaqDNA聚合酶。

表3 正交設計直觀分析Table 3 The orthogonal design of intiutive analysis

2.2 退火溫度以及反應循環(huán)次數(shù)的篩選

退火溫度和循環(huán)次數(shù)對ISSR擴增條帶均有明顯的影響（圖2）。在30次循環(huán)時條帶較少（泳道1～4），從泳道5～8可以看出，在循環(huán)次數(shù)相同時，隨著退火溫度的升高，PCR產(chǎn)物的亮度增加，特異性增強，最佳退火溫度集中在50～55℃。從泳道2，6，9可以看出，在溫度相同時，循環(huán)次數(shù)太少，產(chǎn)物量低，條帶較弱，次數(shù)太多，導致引物二聚體增加，親戚非特異性擴增。由圖2可見，泳道7的條帶最清晰，特異性最強，故以53℃退火，35次循環(huán)為最佳反應條件。

2.3 優(yōu)化反應體系的穩(wěn)定性檢測

隨機選取ISSR引物BUC817和BUC825，采用最優(yōu)體系對部分百脈根種質(zhì)材料進行PCR擴增（圖3），能夠擴增出比較清晰的條帶，且穩(wěn)定性較好，說明該反應體系適合于百脈根的ISSR－PCR反應。

圖1 ISSR反應體系正交設計擴增結果Fig.1 Amplified results of ISSR orthogonal designed reaction system

圖2 不同退火溫度和循環(huán)次數(shù)的擴增結果Fig.2 Effect of annealing temperatures and cycles on PCR amplification

圖3 不同引物在8份百脈根種質(zhì)材料的ISSR擴增結果Fig.3 ISSR fingerprinting of some Lotus corniculatus germplasm

3 討論

PCR反應是ISSR檢測過程中最重要的環(huán)節(jié)，反應體系中各因素的變化均會對擴增結果造成影響。本研究采用正交設計L16（45）方法進行ISSR反應體系優(yōu)化，獲得適合百脈根的ISSR－PCR最適反應條件。結果表明：Mg2＋濃度對反應體系的影響最大，這與王彥華等［14］研究的結果一致。Mg2＋是TaqDNA聚合酶產(chǎn)生聚合反應的必要條件，濃度過低，則對聚合酶的活化作用不夠，濃度過高又會抑制酶的活性；除此以外，Mg2＋濃度與模板DNA以及dNTPs的用量均有關系［15，16］，特別是dNTPs，因為dNTPs分子中的磷酸基團能定量地與Mg2＋結合［17］，從而產(chǎn)生拮抗作用，使實際反映中的Mg2＋濃度下降，從而影響聚合酶的活性。而Taq DNA聚合酶則受到酶活性、反應體積等多方面的影響，酶量過小，使得擴增產(chǎn)量降低，甚至沒有擴增，過大則出現(xiàn)非特異性擴增。對于dNTPs，作為PCR反應的重要底物，其用量的多少直接影響產(chǎn)物的產(chǎn)量，濃度過低就會影響PCR反應，濃度過高則會產(chǎn)生錯誤滲入，容易形成二聚體，從而影響擴增效率，并導致非特異性擴增的發(fā)生。在PCR反應體系中，引物和模板DNA的濃度過小，就會導致兩者結合的機率降低，導致擴增產(chǎn)物的穩(wěn)定性降低；濃度過大則導致擴增過量，出現(xiàn)彌散現(xiàn)象，同時有可能帶入更多的雜質(zhì)。因此，采取正交實驗篩選法，對百脈根ISSR－PCR反應各組成成分的適宜濃度進行了研究，最終確立20μL百脈根ISSR－PCR的反應體系為：40ng模板DNA、2μL 10×PCR Buffer、0.15mmol/L dNTP、0.75μmol/L ISSR引物、1.5mmol/L MgCl2、1UTaqDNA 聚合酶。

在ISSR擴增中，退火溫度和循環(huán)次數(shù)對擴增結果好壞具有明顯影響。退火溫度過低，容易出現(xiàn)背景重，彌散的條帶且擴增產(chǎn)物少；退火溫度過高，則引物與模板結合差，容易造成非特異性擴增，產(chǎn)物的豐富度降低。因此，只有在合適的溫度下才會產(chǎn)生清晰的、特異性的PCR條帶，在選擇最佳退火溫度時，如果擴增結果相近，宜選擇較高退火溫度以提高反應的特異性［18］。此外，不同的引物具有不同的退火溫度，要根據(jù)實際情況逐一篩選，從而獲得穩(wěn)定可靠的標記結果。

相對于單因素設計和完全組合設計，正交設計減少了處理組合，而且考慮了各因素間的相互作用，節(jié)省了人力財力，能夠較快地獲得最優(yōu)體系，但對結果的判斷存在一定的主觀性，因此，在后續(xù)的實驗中還需進一步優(yōu)化，提高穩(wěn)定性和可靠性。研究獲得ISSR反應體系可以為百脈根的后續(xù)工作提供參考，為運用ISSR分子標記技術進行百脈根種質(zhì)資源的遺傳多樣性分析奠定一定的基礎，也為百脈根種質(zhì)資源鑒定，親緣關系分析和優(yōu)良品種選育等方面提供了有益參考。

［1］ Davia R.Managing the Maniototo［M］.Lincoln，New Zealand，AgResearch，1994：27－29.

［2］ 王明玖.百脈根的優(yōu)缺點及其利用管理—與紫花苜蓿比較［J］.國外畜牧學－草原與牧草，1999（2）：122.

［3］ Duke J A.Handbook of Legumes of World Economic Importance［M］.London：Plenum Press，1981.

［4］ 閆向忠，曹致中，馮玉蘭，等.百脈根早熟品系農(nóng)藝性狀初報［J］.甘肅農(nóng)業(yè)大學學報，2007，42（4）：92－96.

［5］ 崔亞飛，曹致中，馬樂元.百脈根單株產(chǎn)量主要農(nóng)藝性狀的相關和通徑分析［J］.甘肅農(nóng)業(yè)大學學報，2009，8（4）：103－106.

［6］ 李玉株，陶蓉，師尚禮，等.百脈根原生質(zhì)體的分離和酶解條件的研究［J］.草地學報，2010，18（6）：798－804.

［7］ 呂德?lián)P，鄧秀葉，王超，等.豆科牧草百脈根原生質(zhì)體和外植體植株的再生［J］.科學通報，1986，10：770－772.

［8］ 劉明志.百脈根愈傷組織原生質(zhì)體再生植株［J］.西北植物學報，1993，16（4）：403－406.

［9］ 程星，包愛科，王鎖明，等.百脈根基因工程研究進展［J］.生物技術通報，2009，4（2）：1－6.

［10］ Zietkiewicz E，Rafslski A，Labuda D.Genome finger print－ing by simple sequence repeat（SSR）－anchored polymerase chain reaction amplification［J］.Genomics，1994，20：176－183.

［11］ 馮鵬，劉榮堂，張?zhí)N薇.分子標記技術在植物空間誘變育種機理研究中的應用［J］.草坪與草坪，2008（2）：1－4.

［12］ 李志勇，孫啟忠，王小麗，等.分子標記技術在牧草種質(zhì)資源研究中的應用［J］.草原與草坪，2010，30（5）：91－96.

［13］ Saghai－Maroof M A，Soliman K M，Jorgensen R A.Ribosomal DNA spacer length polymorphism in barley［J］.Proeeedings of the National Aeademy of Seiences of the United States of Ameriea，1984，81：8104－8108.

［14］ 王彥華，侯喜林，徐明宇.正交設計優(yōu)化不結球白菜ISSR反應體系研究［J］.西北植物學報，2004，24（5）：899－902.

［15］ 鄒喻蘋，葛頌，王曉東.系統(tǒng)與進化植物學中的分子標記［M］.北京：科學出版社，2001：16.

［16］ 王家保，王令霞，劉志媛，等.芒果DNA提取方法比較及ISSR反應體系的優(yōu)化［J］.生物技術，2005，15（5）：37－41.

［17］ 楊水蓮，劉衛(wèi)東，馬濤，等.假儉草ISSR－PCR反應體系的建立與優(yōu)化［J］.草原與草坪，2009（1）：11－14.

［18］ 穆立薔，劉贏男，馮富娟，等.紫椴ISSR－PCR反應體系的建立與優(yōu)化［J］.林業(yè)科學，2006，42（6）：26－31.