苜蓿抗寒性研究進(jìn)展
2012-03-31 18:46:14王運(yùn)濤于林清
草原與草坪 2012年3期
王運(yùn)濤，于林清，薩 仁
（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 草原研究所，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010010）
苜蓿（Medicago sativa）起源于小亞細(xì)亞、外高加索、伊朗和土庫曼高地，是一種優(yōu)良的豆科牧草，素有“牧草之王”的美稱。苜蓿在農(nóng)牧業(yè)生產(chǎn)中起著重要作用，是家畜的主要優(yōu)良飼草，無論是青草還是干草，都具有品質(zhì)優(yōu)良、適口性好的特點(diǎn)。也是農(nóng)作物的良好前茬，可以提高后茬作物的產(chǎn)量。苜蓿也是水土保持植物、蜜源植物，也可以作為蔬菜、食品利用［1］。正因?yàn)槿绱?，苜蓿在世界范圍?nèi)具有廣泛的栽培面積，約有3 300萬hm2，其中，北美洲所占比重最大，歐洲次之，第3位是南美洲，相繼為亞洲，非洲，大洋洲最少。美國種植面積最大，超過1 000萬hm2，阿根廷為700多萬hm2。進(jìn)入21世紀(jì)以來我國的栽培面積在一直維持在230～260萬hm2［2－5］。在我國北方高緯度、高海拔地區(qū)，由于低溫、干旱等原因造成苜蓿的越冬率低，且容易發(fā)生凍害和死亡現(xiàn)象，從而造成苜蓿的大面積減產(chǎn)。低溫已經(jīng)成為限制我國北方苜蓿產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重要環(huán)境因素。苜蓿的越冬問題也已經(jīng)成為制約我國北方苜蓿草地成功建植和草地可持續(xù)利用的關(guān)鍵問題［6］。因此，研究苜蓿的抗寒性具有重要的理論和實(shí)際意義。
1 苜蓿的形態(tài)結(jié)構(gòu)與抗寒性關(guān)系
1.1 莖葉的形態(tài)結(jié)構(gòu)與抗寒性的關(guān)系
莖和葉作為植物暴露在環(huán)境中的組織或器官最易受到并反映環(huán)境諸因子變化所帶來的影響。目前，有關(guān)苜蓿莖葉形態(tài)結(jié)構(gòu)對低溫適應(yīng)性的報(bào)道較少。劉香萍等［7］研究發(fā)現(xiàn)，葉節(jié)長度與抗寒性之間相關(guān)性不大，但第一真葉葉腋枝條長度卻與抗寒性呈顯著正相關(guān)，可作為評價(jià)苜?？购阅艿膮⒖贾笜?biāo)［7］。孫啟忠等［8］研究表明，播種當(dāng)年分枝數(shù)的多少、株高及單株重量在不同播期間差異顯著，播種期越早則分枝增多、株高及單株重提高，苜蓿越冬率也相應(yīng)增加。崔國文等［9］研究結(jié)果報(bào)道，苜蓿的越冬率與葉片寬長比呈顯著負(fù)相關(guān)，葉片相對窄的品種，其越冬能力強(qiáng)，抗寒性較好，反之則差。同時(shí)氣孔密度大，葉片組織緊密度大、疏松度小，葉脈凸起度大的苜蓿抗寒性較強(qiáng)。
1.2 根系類型與抗寒性
根系是植物吸收和貯存營養(yǎng)物質(zhì)的重要器官，根系生長發(fā)育的狀況直接影響到地上部分的產(chǎn)量。苜蓿為軸根型植物，根系發(fā)達(dá)［10］。苜蓿的抗寒性在很大程度上取決于根系，其根系具有3種類型：直根型、根莖型、根蘗型。根莖型苜蓿可形成地下莖，可以自身更新，當(dāng)主根枯死后，可與母株分離而保持獨(dú)立生存，因此比單個(gè)主根更能忍受凍害［11－13］。根蘗型苜蓿因具有大量側(cè)根（水平根）而具有較強(qiáng)的抗寒性。但國內(nèi)一些地區(qū)引種觀察表明，根蘗型苜蓿并不表現(xiàn)出比直根型苜蓿更抗寒，根蘗型特性具有非常明顯的地域性，由此造成了抗寒性的差異［14］。因此，關(guān)于根系類型與抗寒性的關(guān)系還有待于進(jìn)一步研究。
苜蓿的根頸與抗寒性關(guān)系密切。根頸是苜蓿根與莖的結(jié)合部位，也是地上部分和地下部位物質(zhì)交換過程中，營養(yǎng)物質(zhì)貯藏的樞紐部位，在苜蓿的生長過程中，根頸能形成大量的芽，從而形成地上部莖枝，也是越冬芽著生的部位。并且可以隨著生長年限的增加逐漸加粗和向土中深入。當(dāng)溫度變化幅度大時(shí)，苜蓿根頸容易受到傷害。在冷熱交替變化中，根頸細(xì)胞間隙水分發(fā)生凍融交替變化，會引起根頸和根細(xì)胞受損。對受凍害后紫花苜蓿根頸再生方法的研究發(fā)現(xiàn)，通過除去凍害部位，可防止根系繼續(xù)腐爛，使根系與地面的距離變短或露出地面從而增加光照強(qiáng)度，可促使未受凍害的根系發(fā)芽［15］。根頸入土越深根頸越粗，越容易越冬。孫啟忠等［16］在苜蓿播種時(shí)不同覆土厚度的研究中發(fā)現(xiàn)覆土厚根頸入土深，根頸受凍害的可能減小，同時(shí)根頸的入土深度又促進(jìn)了根頸生長膨大，增強(qiáng)了植株的耐寒性，從而提高了越冬率。史紀(jì)安等［17］通過對不同秋眠級別的紫花苜蓿品種根系發(fā)育能力的研究，結(jié)果表明根頸分枝能力強(qiáng)、增粗速度快，入冬前根頸粗壯入土較深，積累越冬營養(yǎng)物質(zhì)多，有利于翌年萌發(fā)枝條和實(shí)現(xiàn)高產(chǎn)，同時(shí)根頸隨氣溫下降而向土壤中下移，提高冬季的抗寒能力。
2 低溫下苜蓿植株的生理生化的適應(yīng)性變化
植物只有在生長過程中不斷的與環(huán)境進(jìn)行物質(zhì)和能量的交換才能維持其生命活動。外界環(huán)境條件的好壞直接決定著植株的生存狀況。尤其是不良環(huán)境，會引起植物體內(nèi)一系列的生理生化變化，主要表現(xiàn)為對生長和發(fā)育的抑制，嚴(yán)重時(shí)會導(dǎo)致植株的死亡。
2.1 細(xì)胞膜透性與抗寒性
苜蓿的抗寒性與細(xì)胞膜透性有著密切的關(guān)系。在低溫脅迫下，苜蓿的細(xì)胞膜受損，膜透性增大。而抗寒性強(qiáng)的品種其細(xì)胞膜透性較抗寒性差的品種要小，電解質(zhì)滲出率低［18，19］。鄧雪珂等［20］通過對苜蓿進(jìn)行0～－7℃冷處理后測定了離體葉片的質(zhì)膜電導(dǎo)率，結(jié)果表明，隨著溫度的降低，苜蓿葉片的電導(dǎo)率總體呈現(xiàn)增長趨勢。在0～－3℃時(shí)，與未經(jīng)低溫脅迫相比呈緩慢增加，而在－3～－4℃之間時(shí)電導(dǎo)率明顯增加，表明葉片細(xì)胞的質(zhì)膜通透性增大。由此可以看出，當(dāng)超過－4℃時(shí)，苜蓿的葉片質(zhì)膜就會受到嚴(yán)重的冰凍傷害，而對于－3℃的低溫就有較好的抵御能力［20］。
2.2 碳水化合物與抗寒性
當(dāng)植物經(jīng)受低溫脅迫時(shí)，植物組織的胞內(nèi)糖含量會呈現(xiàn)增加的趨勢。研究認(rèn)為糖可以經(jīng)低溫代謝產(chǎn)生未知有效變化，或者通過滲透作用增加植株的抗性。有報(bào)道稱低溫下植株中可溶性糖的積累是作為滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)和防脫水劑而起作用，在低溫脅迫下，可以降低細(xì)胞水勢、增強(qiáng)持水力［21］。有報(bào)道苜蓿主根中非結(jié)構(gòu)性碳水化合物（蔗糖、葡萄糖、總還原糖及總糖）的濃度抗寒性形成階段明顯增加但在春天苜蓿返青時(shí)下降［22］。陶雅等［23］通過對國內(nèi)外6個(gè)紫花苜蓿品種在不同時(shí)間的根部可溶性糖含量的動態(tài)變化分析，結(jié)果表明，苜蓿根內(nèi)的可溶性糖含量從9月中旬開始升高，11月中旬達(dá)到最高峰，之后開始逐漸下降，一直延續(xù)到次年5月中旬，說明可溶性糖是一種低溫保護(hù)物質(zhì)，能夠提高苜蓿對低溫脅迫的適應(yīng)。但也有研究認(rèn)為，在冷適應(yīng)階段糖積累并沒有隨品種抗寒性的不同而表現(xiàn)出明顯的趨勢性變化。越冬率低的Aurora苜蓿含糖量一直處于較高水平，這可能是這一品種存活植株對當(dāng)?shù)貧夂驐l件適應(yīng)性的反應(yīng)［24］。因此，不能單純把糖分含量作為區(qū)別苜?？购詮?qiáng)弱的指標(biāo)。有關(guān)可溶性糖與抗寒性的關(guān)系還有待于進(jìn)一步研究。
2.3 脯氨酸與抗寒性
氮代謝是植株體內(nèi)最基本的物質(zhì)代謝之一，是植物正常生長發(fā)育的物質(zhì)基礎(chǔ)。研究結(jié)果表明，氮直接關(guān)系到苜蓿的再生與返青，苜蓿再生及返青時(shí)所消耗的氮均來自根部。隨著氣溫逐漸變低，苜蓿根部氨基酸總量會顯著升高，并在冬季維持較高的水平，直到第2年早春返青時(shí)下降。游離脯氨酸作為細(xì)胞質(zhì)的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)在植物對抗低溫脅迫時(shí)起到平衡細(xì)胞代謝的作用，以保持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的相對穩(wěn)定［25］。有試驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)受到低溫脅迫時(shí)，植株游離脯氨酸的含量開始上升，隨著低溫處理時(shí)間的延長，紫花苜蓿游離脯氨酸的含量有大幅度的增加，特別是在低溫脅迫12h后，增長十分明顯，說明游離脯氨酸在紫花苜蓿中作為一種植株耐寒性相關(guān)物質(zhì)而存在，隨低溫脅迫的時(shí)間增加逐漸積累，在12h后相關(guān)積累機(jī)制大量激活，導(dǎo)致其含量急劇上升［20］。這證明了苜蓿對低溫的適應(yīng)機(jī)制是通過提高胞內(nèi)小分子物質(zhì)的絕對含量來實(shí)現(xiàn)的；脯氨酸絕對含量的增加有利于提高苜蓿的抗寒性［26］。
2.4 脂肪酸與抗寒性
植物的細(xì)胞膜脂肪酸的不飽和程度越高，其相變溫度越低，抗寒性越強(qiáng)。在低溫鍛煉時(shí)苜?？购贩N的脂類增多，其中，主要是亞油酸和亞麻酸含量增加以及膜組分磷脂的增加。苜蓿細(xì)胞膜脂肪酸的不飽和程度升高，類脂的相變溫度下降，這時(shí)細(xì)胞膜從正常的生理活動狀態(tài)液晶態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)榻Y(jié)晶態(tài)，可在低溫下維持細(xì)胞膜的正常功能，因而苜蓿的抗寒能力增強(qiáng)［27］。夏明等［28］通過對20種苜蓿葉片膜脂脂肪酸組分和變化的分析，發(fā)現(xiàn)在5℃低溫狀態(tài)下，苜蓿品種間葉片膜脂棕櫚稀酸和亞麻酸含量高、變化率大，表現(xiàn)出對低溫環(huán)境的敏感，為苜蓿的抗寒指示性脂肪酸。
2.5 保護(hù)酶系統(tǒng)變化與抗寒性
在正常情況下，植物體內(nèi)活性氧和自由基的產(chǎn)生和清除之間處于平衡狀態(tài)，而當(dāng)植物受到低溫脅迫時(shí)，這種平衡就會受到破壞，植物細(xì)胞就會受到損傷。植物體內(nèi)活性氧清除劑包括抗氧化酶和抗氧化劑。其中，抗氧化酶主要有：超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）、過氧化氫酶（CAT）、抗壞血酸過氧化物酶（APX）、脫氫抗壞血酸還原酶（DHAR）、谷胱甘肽還原酶（GR）等。非酶性的抗氧化劑如壞血酸（ASA）、谷胱甘肽（GSH）和維生素E等［29］。SOD、POD是植物對膜脂過氧化的酶促防御系統(tǒng)中重要的保護(hù)酶，SOD在細(xì)胞保護(hù)酶系統(tǒng)中的作用是清除超氧自由基O2－，同時(shí)產(chǎn)生歧化產(chǎn)物H2O2。POD在保護(hù)酶系統(tǒng)中主要起到酶促降解H2O2的作用，從而使植物抵抗在逆境脅迫下代謝過程產(chǎn)生的有害物質(zhì)對細(xì)胞的傷害，表現(xiàn)出一定的抗逆性［30］。在低溫脅迫初期，幼苗葉片SOD、POD活性上升，隨著脅迫時(shí)間的延長，在脅迫后期苜蓿幼苗葉片SOD、POD保護(hù)酶的活性下降后仍能維持較高水平的活性，這可能是SOD、POD保護(hù)酶的活性的耐寒機(jī)制已經(jīng)形成，酶的活性維持在較高水平，能夠使活性氧代謝處于一定的平衡，避免了活性氧等各種自由基的大量積累，減輕了膜脂過氧化作用，降低了細(xì)胞膜的破壞程度，增強(qiáng)了對低溫的適應(yīng)能力［23］。楊秀娟［31］在對抗寒性差異較大的2個(gè)苜蓿品種于不同時(shí)期進(jìn)行取樣，然后測定根頸的POD，SOD和CAT酶活性，結(jié)果表明：從夏季到冬初，紫花苜蓿2個(gè)品種根頸中的POD，SOD和CAT酶活性均隨著季節(jié)溫度的降低而呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，在初冬是達(dá)到頂峰，進(jìn)入冬季深秋眠間，3種酶活性均有一定的波動，且活性明顯下降。梁慧敏等［32］通過對秋末初冬和初春返青期同工酶的變化研究，結(jié)果表明，秋冬隨溫度的降低，苜蓿過氧化物酶同工酶譜帶和活性明顯增加，且根蘗型增加快于直根型苜蓿；而早春隨溫度的上升，苜蓿根系酶活性和酶帶數(shù)也呈波動式變化，與溫度呈明顯的負(fù)相關(guān)關(guān)系，其中，對溫度變化敏感的根蘗型苜蓿與直根型苜蓿相比，根酶活性始終保持較高水平，有利于及時(shí)清除細(xì)胞內(nèi)的有毒物質(zhì)，保護(hù)生物膜不受損害。魏臻武等［33］利用聚丙烯酰胺凝膠電泳分析結(jié)果表明，不同苜蓿品種具有6條共同的SOD同工酶酶帶，適應(yīng)高寒地區(qū)氣候條件的當(dāng)?shù)夭牧贤码s種苜蓿表現(xiàn)出與其它苜蓿品種較大的特異性。
2.6 激素變化與抗寒性
隨著秋冬溫度的下降，植物的生長活力呈現(xiàn)下降趨勢，植株體內(nèi)的激素發(fā)生明顯變化，主要表現(xiàn)為ABA大量增多，GA和IAA等促生長激素的減少。ABA既可以誘發(fā)與抗逆相關(guān)的新的蛋白質(zhì)合成，增強(qiáng)抗逆性，也可以促進(jìn)氣孔關(guān)閉，減少水分損失，維持體內(nèi)水分平衡，減少逆境傷害。有許多試驗(yàn)結(jié)果已經(jīng)證實(shí)植物經(jīng)低溫處理后內(nèi)源ABA含量明顯增加，且抗寒性強(qiáng)的品種ABA含量高于抗寒性弱的品種［34］。對植物施加外源ABA激素會影響內(nèi)源ABA激素的合成。王成章等［35］通過對不同秋眠類型苜蓿品種施加外源ABA的試驗(yàn)結(jié)果表明，無論是秋眠型、半秋眠型或非秋眠型苜蓿，噴施外源ABA對苜蓿體內(nèi)ABA的積累均有極顯著的促進(jìn)作用；又由其株高增長變化看，高濃度外源ABA處理對苜蓿生長抑制更加明顯，但秋眠型苜蓿較半秋眠型和非秋眠型更易受外源ABA誘導(dǎo)而增加內(nèi)源ABA的累積量。因此，若施用外源ABA改變苜蓿體內(nèi)的平衡狀況來誘導(dǎo)基因的表達(dá)從而誘導(dǎo)秋眠反應(yīng)，提高苜蓿抗寒能力，可根據(jù)秋眠級別的不同施以不同濃度的外源ABA或類似物。
3 苜蓿的秋眠性與抗寒性的關(guān)系
秋眠性是與日照變化有關(guān)的一種秋季生長特性，是對短日照的一種生長反應(yīng)。在高緯度地區(qū)秋季日照長度的降低，引起苜蓿植株出現(xiàn)俯臥生長，且生長速度下降，這種特性即為苜蓿的秋眠性。具有這種特性的苜蓿品種即為秋眠苜蓿，而不表現(xiàn)這種現(xiàn)象的苜蓿則為非秋眠苜蓿。在極端秋眠和極端非秋眠的品種之間，還存在不同的過渡類型，并可以此將苜蓿品種分為不同的秋眠級［36］。國際上通常用秋眠級表示苜?？购芰Φ拇笮。?7］。在國外，秋眠級別是苜蓿品種選擇首先需要考慮的因素。美國已把苜蓿秋眠性列為品種鑒定的一個(gè)首要指標(biāo)。我國對苜蓿的秋眠性研究最早的是盧欣石［38］，他以美國9個(gè)秋眠標(biāo)準(zhǔn)對照品種為對照，對中國23個(gè)國家審定苜蓿品種進(jìn)行了秋眠性評定，分析表明中國苜蓿國家審定品種中大部分為秋眠性品種。于林清等［39］在2000年同樣以美國9個(gè)秋眠性標(biāo)準(zhǔn)對照品種為參照，測定了我國新疆野生苜蓿種群117份材料的秋眠性，結(jié)果表明，新疆北疆苜蓿野生種群沒有半秋眠種質(zhì)，參試的85份苜蓿品種中，秋眠級為1的84份，秋眠級為3的1份；而我國南疆的32份中1和3級品種分別為24和2份，4和5級的分別為4和2份。許多試驗(yàn)表明，苜蓿品種的秋眠習(xí)性與其再生能力、潛在產(chǎn)量特別是苜蓿耐寒性高度相關(guān)。秋眠型苜蓿品種抗寒性強(qiáng)，但產(chǎn)量相對較低，再生較慢；非秋眠型苜蓿品種抗熱抗病性強(qiáng)，產(chǎn)量高，再生快，但耐寒性差；半秋眠型苜蓿品種介于兩者之間［40］。但是，也有學(xué)者認(rèn)為秋眠性與抗寒性之間不存在因果關(guān)系，這2個(gè)性狀之間之所以密切關(guān)聯(lián)很可能與不同類型苜蓿的起源有關(guān)。秋眠性與抗寒性可以分離，有可能培育出既有旺盛的秋季生長（非秋眠性）、又有較強(qiáng)抗寒性（持久性）的苜蓿品種［32，41］?？购耘c秋眠性的關(guān)系仍是今后研究中所要解決的問題之一。
4 生物技術(shù)在苜?？购N中的應(yīng)用
苜?？购N以前主要依靠傳統(tǒng)的育種方法，但由于周期長、效果差且工作繁瑣，不能適應(yīng)現(xiàn)代農(nóng)業(yè)發(fā)展的需求［42］。最近10年來，隨著對抗寒分子機(jī)理認(rèn)識的不斷加深以及生物技術(shù)的發(fā)展，人們不斷嘗試采用一些現(xiàn)代生物技術(shù)來培育抗寒新品種。楊志宏等［43］以準(zhǔn)格爾苜蓿莖段誘導(dǎo)愈傷組織，對愈傷組織進(jìn)行0～－10℃的低溫篩選，獲得抗寒性突變體，并用生理生化方法對突變的愈傷組織體細(xì)胞的抗寒性進(jìn)行了鑒定，為抗寒育種提供了原始材料。李波等［44］對誘導(dǎo)的苜蓿愈傷組織進(jìn)行不同濃度的硫酸二乙酯（DES）誘變處理，確定其半致死濃度，在－7℃低溫下進(jìn)行篩選，已獲得抗寒性突變體；進(jìn)行了相對電導(dǎo)率、游離脯氨酸含量、過氧化物酶的活性等抗寒生理指標(biāo)的測定。結(jié)果表明，苜蓿愈傷組織經(jīng)DES處理，DES的半致死濃度為0.3%，愈傷組織的抗寒性增強(qiáng)。李繼平［45］通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)，將從擬南芥中克隆得到的冷誘導(dǎo)基因的轉(zhuǎn)錄因子CBF1轉(zhuǎn)入優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)的苜蓿植株中，得到轉(zhuǎn)化植株，經(jīng)過PCR分子檢測初步得到轉(zhuǎn)基因植株，為篩選出抗寒高產(chǎn)的轉(zhuǎn)基因苜蓿株系奠定了基礎(chǔ)。
5 輻射誘變與太空搭載對抗寒性影響
尚晨等［46］利用高能粒子場進(jìn)行不同輻照劑量處理種子，研究龍牧803苜蓿M2代低溫下的生理變化，結(jié)果表明高能粒子處理紫花苜蓿種子提高了苜蓿的抗寒性，在低溫條件下，輻射劑量越高，輻射效應(yīng)越明顯。張文娟［47］以4個(gè)高產(chǎn)紫花苜蓿品種優(yōu)質(zhì)種子為對象，通過返回式育種衛(wèi)星“神州3號”搭載，返地后進(jìn)行低溫脅迫處理，測定各種指標(biāo)，結(jié)果表明，空間搭載對4個(gè)紫花苜蓿品種的質(zhì)膜過氧化及細(xì)胞膜相對透性、游離脯氨酸含量有影響。低溫脅迫下，各品種搭載組與其對照組質(zhì)膜透性、丙二醛含量都呈上升趨勢，搭載組質(zhì)膜透性、丙二醛含量小于其對照，搭載組質(zhì)膜過氧化程度小于對照；各品種搭載組與其對照組游離脯氨酸含量變化趨勢一致，但隨溫度下降，搭載組游離脯氨酸積累量大于其對照，這些生理變化都有利于苜?？购缘奶嵘?/p>
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由以上可知我們對苜蓿的抗寒性已經(jīng)進(jìn)行了多方面的研究，并且也取得了一定的研究成果，對苜蓿適應(yīng)低溫的機(jī)理也有了一定的認(rèn)識。但我國在苜?？购缘难芯恐羞€存在很多問題。比如：有哪些基因參與苜蓿的抗寒性形成，這些基因控制酶的形成進(jìn)而影響表型變化的機(jī)制還有待于進(jìn)一步研究；根系類型與抗寒性、在人工低溫脅迫下保護(hù)酶變化情況與抗寒性、苜蓿的秋眠性與抗寒性的關(guān)系還不是特別清楚；快速、簡潔、準(zhǔn)確的鑒定苜?？购缘慕y(tǒng)一指標(biāo)還未形成。如何在苜?？购缘难芯恐屑哟笮碌纳锛夹g(shù)的應(yīng)用，使傳統(tǒng)育種技術(shù)與現(xiàn)代育種技術(shù)相結(jié)合，加速育種進(jìn)程，快速有效的提升苜蓿的抗寒性是我們今后需要努力的研究方向。
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