高曉星，陳秀蓉

（甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 草業(yè)學(xué)院/草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/中－美草地畜牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展研究中心，甘肅 蘭州 730070）

高山被孢霉是一種絲狀的腐生菌，含有豐富的多糖和蛋白質(zhì)。廣泛分布于土壤內(nèi)、牲畜的糞便中及其他腐敗的有機(jī)物質(zhì)上［1］。1987年Totani首次發(fā)現(xiàn)高山被孢霉，隸屬于接合真菌亞門。作為自然界的拓荒者，可以直接發(fā)酵生產(chǎn)糖化酶和蛋白酶類等，同時(shí)，還可以發(fā)酵生產(chǎn)（GLA）等有機(jī)酸［2］。根據(jù)醫(yī)學(xué)研究相關(guān)報(bào)道，GLA具有諸多藥用價(jià)值和營養(yǎng)價(jià)值，對(duì)糖尿病、心臟病、高血壓、高血脂、中風(fēng)、過敏性濕疹等疾病都具有明顯的療效、可促進(jìn)被酒精損傷肝功能的恢復(fù)，對(duì)免疫系統(tǒng)疾病具有調(diào)節(jié)作用［3，4］。另外，由于高山被孢霉的生長繁殖速度快、資源豐富、油脂含量高、生長周期短、碳源利用譜廣和不受氣候限制等特點(diǎn)，這就有利于實(shí)現(xiàn)大規(guī)模生產(chǎn)，這一工業(yè)生產(chǎn)研究就是要加快微生物油脂發(fā)酵技術(shù)創(chuàng)新和產(chǎn)業(yè)化進(jìn)程，可為我國未來生物柴油產(chǎn)業(yè)化和油脂化工行業(yè)的健康發(fā)展提供保障。隨著現(xiàn)代生物技術(shù)的發(fā)展使產(chǎn)油微生物的研究技術(shù)在不斷趨向成熟。1988年Shimizu等［5］認(rèn)為高山被孢霉是可以進(jìn)行商業(yè)化生產(chǎn)的一個(gè)潛在資源，同時(shí)，高山被孢霉也被認(rèn)為是產(chǎn)生多價(jià)不飽和脂肪酸的優(yōu)良微生物［6，7］，國內(nèi)對(duì)高寒草地土壤真菌的研究剛剛起步，而高山被孢霉是東祁連山高寒草地土壤真菌中的優(yōu)勢(shì)種群［8］。另外，高山被孢霉用于產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)所要求的指標(biāo)不僅要合成高水平的不飽和脂肪酸酯，也要有較高的生物量，要達(dá)到此目的，適宜的營養(yǎng)成份及配比對(duì)提高孢子萌發(fā)率、增加菌絲分枝和強(qiáng)壯菌絲體都是十分重要［9］。因此，研究以3種高山被孢霉為對(duì)象，單因素對(duì)不同碳氮源、溫度、pH、濕度及光照強(qiáng)度等培養(yǎng)條件進(jìn)行摸索，以期找到高山被孢霉菌絲生長最佳的培養(yǎng)條件，從而為高山被孢霉的進(jìn)一步研究提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 供試菌株

供試菌株M.ap 27，M.ap 60和M.ap 9是由課題組從東祁連山高寒草地土壤中分離獲得，由甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 供試培養(yǎng)基

PDA培養(yǎng)基由馬鈴薯200g、瓊脂8g、葡萄糖20g、H2O 1 000mL，用于3種高山被孢霉菌種活化；察氏培養(yǎng)基NaNO33g、K2HPO41g、MgSO4·7H2O 0.5g、KCI 0.5g、FeSO40.01g、30g、瓊脂20g、H2O 1 000mL，用于供試菌株生長溫度和pH的篩選測(cè)定；基礎(chǔ)培養(yǎng)基為FeSO40.01g、KCI 0.5g、K2HPO41g、瓊脂8g、H2O 1 000mL，用于高山被孢霉利用碳、氮源的對(duì)照；供試碳源培養(yǎng)基是在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，加入0.2%NaNO3，再分別加入3% 葡萄糖、麥芽糖、蔗糖、淀粉、乙酸鈉等碳源，各處理重復(fù)3次；供試氮源培養(yǎng)基也是在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，加入3%葡萄糖，再分別加入0.2%KNO3、尿素、氯化銨、蛋白胨、硝酸銨等氮源，各處理重復(fù)3次。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 pH值對(duì)菌落生長的測(cè)定 從實(shí)驗(yàn)室挑選出3株高山被孢霉接種到PDA培養(yǎng)基上活化培養(yǎng)，用直徑0.6cm的打孔器切取菌餅，分別接種于察氏培養(yǎng)基，制備好的PDA培養(yǎng)基利用酸度計(jì)，通過0.1mol/L NaOH溶液和0.1mol/L HCl溶液將培養(yǎng)基濃度調(diào)節(jié)為4、5、6、7、8、9不同的6個(gè)梯度，再將活化好的供試菌株分別點(diǎn)接在培養(yǎng)基上，各處理重復(fù)3次。25℃恒溫培養(yǎng)7d，利用十字交叉法測(cè)量并記錄菌落直徑。連續(xù)測(cè)量5次，計(jì)算出菌落的平均生長速率。所得數(shù)據(jù)用DPS軟件進(jìn)行方差分析。

1.3.2 光照強(qiáng)度對(duì)菌落生長的測(cè)定 將活化好的供試菌株接到察氏培養(yǎng)基之后，置于可控光照培養(yǎng)箱內(nèi)，分別將光照強(qiáng)度設(shè)置為200lx、400lx、600lx、800lx，以沒有光照的處理為對(duì)照。培養(yǎng)方法同1.3.1所述。

1.3.3 濕度對(duì)菌落生長的測(cè)定 將3種高山被孢霉接種到察氏培養(yǎng)基中，利用濃硫酸將濕度調(diào)節(jié)為10%、25%、35%、50%、65%、75%、90%（表1）［10］，培養(yǎng)方法同1.3.1所述。

表1 硫酸濃度與相對(duì)濕度的關(guān)系Table 1 The relationship of sulfuric acid concentration and relative humidity

1.3.4 3種高山被孢霉對(duì)多種碳源、氮源利用能力的測(cè)定 將待測(cè)菌株點(diǎn)接到供試碳源培養(yǎng)基或氮源培養(yǎng)基上，其中，供試碳源有葡萄糖、麥芽糖、蔗糖、淀粉、乙酸鈉；供試氮源有KNO3、尿素、氯化銨、蛋白胨、硝酸銨。各處理重復(fù)3次，然后置于25℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，以基礎(chǔ)培養(yǎng)基作為對(duì)照（ck）。培養(yǎng)方法同1.3.1所述。

2 結(jié)果與分析

2.1 pH對(duì)菌絲生長的影響

pH對(duì)菌絲生長的影響結(jié)果（表2）。不同pH處理下3種高山被孢霉都能生長，其中，M.ap 27在中性偏酸性（pH＝5～7）的培養(yǎng)基上菌絲生長速率都大于0.9cm·d－1，并與在堿性培養(yǎng)基（pH 8～9）具有顯著差異；M.ap 60和M.ap 9的最適宜生長pH為7。另外，在pH 為7時(shí)，M.ap 60的生長速率（1.12cm/d）要大于 M.ap 27（0.96cm/d）和 M.ap 9（0.60cm/d）的生長速率?？梢?，3種高山被孢霉對(duì)酸堿的適應(yīng)范圍較廣，而M.ap 60對(duì)的土壤酸堿有更好的適應(yīng)性。

表2 pH對(duì)3種高山被孢霉菌絲生長的影響Table 2 Effects of pH on hypha growth of three Mortierella alpina strains

2.2 光照強(qiáng)度對(duì)菌絲生長的影響

光照強(qiáng)度對(duì)菌絲生長的影響（表3），在弱光強(qiáng)（200～600lx）的處理下，M.ap 27的生長速率與光照強(qiáng)度成正比，光照強(qiáng)度越大菌絲生長速率越大，其中，光強(qiáng)為600lx時(shí)，M.ap 27的生長速率最快，達(dá)到0.71 cm/d，與對(duì)照之間（0.57cm/d）存在顯著差異；M.ap 60的生長速率在600lx的光照下達(dá)到最大值，為0.67 cm/d，M.ap 9在400lx的光強(qiáng)下生長速率為0.74 cm/d，與其他處理之間存在顯著差異。

表3 光照強(qiáng)度對(duì)3種高山被孢霉菌絲生長的影響Table 3 Effects of Light intensity on hypha growth of three Mortierella alpina strains

2.3 濕度對(duì)菌絲生長的影響

濕度對(duì)菌絲生長的影響結(jié)果（表4），在濕度小于75%時(shí)，M.ap 27的生長速率隨著濕度的增加呈增長趨勢(shì)，而濕度達(dá)到90%時(shí)就會(huì)抑制菌絲的生長速率。當(dāng)濕度為75%時(shí)，3種高山被孢霉的菌絲生長速率達(dá)到最大值，可見濕度過低或過高都會(huì)抑制菌絲的平均生長速率。

表4 濕度對(duì)3種高山被孢霉菌絲生長的影響Table 4 Effects of humidity on hypha growth of three Mortierella alpina strains

2.4 菌絲對(duì)多種碳源、氮源的利用能力

3種高山被孢霉在不同的碳源培養(yǎng)基上具有顯著差異。其中，M.ap 27在淀粉和蔗糖培養(yǎng)基上菌絲生長速率最快，分別為1.06cm/d和0.99cm/d，與對(duì)照差異顯著，最適碳源為淀粉，麥芽糖和葡萄糖對(duì)菌落生長的影響與對(duì)照（0.77cm/d）差異不顯著，而在乙酸鈉的處理下，菌絲生長速率為0.35cm/d，對(duì)菌絲生長有顯著的抑制作用。M.ap 60在蔗糖與淀粉培養(yǎng)基上菌絲生長速率在0.92～1.0cm/d，與對(duì)照之間存在顯著差異，而麥芽糖、葡萄糖培養(yǎng)基與ck之間沒有差異，乙酸鈉對(duì)其生長有抑制作用；M.ap 9在葡萄糖培養(yǎng)基上生長速率最快，為0.61cm/d，可見，M.ap 9的最適碳源為葡萄糖，除麥芽糖對(duì)其生長有促進(jìn)作用外，其他碳源對(duì)菌絲生長的影響與對(duì)照都沒有顯著差異。因此，3種高山被孢霉在各自最適的培養(yǎng)條件下，M.ap 27的生長速率最快（表5）。

表5 不同碳源對(duì)3種高山被孢霉菌絲生長的影響Table 5 Effects of C－source on hypha growth of three Mortierella alpine strains

3種高山被孢霉的最適宜氮源都為蛋白胨，對(duì)于M.ap 27而言，其他氮源也都有促進(jìn)菌絲生長的作用，并且與對(duì)照之間具有顯著差異；氯化銨和硝酸銨對(duì)M.ap 60的生長仍然有促生作用，而硝酸鉀和尿素對(duì)其生長的影響與對(duì)照之間沒有顯著差異；硝酸鉀對(duì)M.ap 9的菌絲生長有促生作用，而氯化銨對(duì)其有抑制作用，M.ap 9對(duì)各種氮源的利用能力與對(duì)照之間差異都不顯著（表6）。

表6 不同氮源對(duì)3種高山被孢霉菌絲生長的影響Table 6 Effects of N－source on hyphae growth of three Mortierella alpina strains

3 討論與結(jié)論

試驗(yàn)從pH、光照強(qiáng)度、濕度及碳氮源等方面對(duì)3種高山被孢霉的生物學(xué)特性進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果表明不同處理下3種高山被孢霉的生物學(xué)特性具有顯著差異。3菌株在pH 4～9范圍內(nèi)均能生長，最適宜pH為7；M.ap 27的最適碳源為淀粉，M.ap 60的最適碳源為蔗糖，M.ap 9的最適碳源為葡萄糖；M.ap 27，M.ap 60和M.ap 9的最適氮源均為蛋白胨。3種高山被孢霉在基礎(chǔ)培養(yǎng)基上都能生長，證說明有較強(qiáng)的適應(yīng)貧瘠營養(yǎng)環(huán)境的能力。供試菌株在6種碳氮源培養(yǎng)基上均可生長，表明供試菌對(duì)碳源利用較為廣泛，不僅能利用單糖等速效碳源，而且還能利用淀粉等長效碳源，說明其在加速凋落物的降解過程中發(fā)揮著重要的作用［11］。另外，不同種的高山被孢霉對(duì)同一種碳源或氮源的利用能力不同，這說明不同種高山被孢霉由于生理特性有差異，對(duì)碳或氮源的要求不同［12］。由于在初試條件下3種高山被孢霉能夠在0～35℃下存活，故將溫度設(shè)定為25℃，但實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明3供試菌株的菌絲生長速率之間存在很大差異，可能與供試菌的最適溫度有關(guān)，而這也是本試驗(yàn)的沒有考慮到的不足之處。因此，對(duì)于高寒草地土壤中高山被孢霉的研究還需要從更多方面的生物學(xué)特性及功能進(jìn)行試驗(yàn)，為產(chǎn)脂微生物的工業(yè)發(fā)酵產(chǎn)業(yè)及醫(yī)學(xué)方面的應(yīng)用提供依據(jù)。

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