押輝遠, 李衛(wèi)濤, 王衛(wèi)東, 焦 貞

(1.洛陽師范學院 生命科學系 河南 洛陽 471022; 2.鄭州大學 河南省離子束生物工程重點實驗室 河南 鄭州 450052)

0 引言

禾本科(Poaceae)植物是單子葉植物(Orchidaceae)中的第2大科，有近700屬，約11 000種.我國有190多屬，1 200多種[1].不僅包括了水稻(OryzasativaL.)、小麥(TriticumaestivumL.)和玉米(ZeamaysL.)三大糧食作物，還包括高粱(SorghumMoench)、甘蔗(SaccharumL.)等其他重要經濟作物，其中一些雜草是生態(tài)學的優(yōu)勢物種和先鋒植物[2].然而禾本科的亞科和族的劃分一直存在較大爭議:Clayton等[3]將禾本科分成6個亞科；而Soderstrom等[4]則把稻族和菰族從亞科中分離出來，置于稻亞科中，形成7亞科；GPWG[5]通過對質體DNA和核DNA數據分析及結合形態(tài)學的方法將禾本科劃分成12個亞科.

隨著分子生物學的發(fā)展，基于基因序列的分子數據已被廣泛應用于物種分類學、系統(tǒng)學和種群遺傳學的研究中.植物延伸因子EF1-a是真核生物細胞內的第二大蛋白，并且在蛋白質合成延伸過程中起重要作用[6].許多禾本科植物如大麥、玉米、小麥、水稻等的EF1-a互補DNA (complement DNA, cDNA)序列已經測定，通過比較分析多種植物的EF1-a基因編碼的氨基酸序列，發(fā)現種間的EF1-a基因編碼的氨基酸序列高度保守，同源性高于95%[7]，適合用于種系發(fā)生分析，可以作為研究系統(tǒng)發(fā)育的有力工具[8].目前，依據形態(tài)學、不同來源(核基因組、葉綠體基因組或線粒體基因組)的基因序列開展的禾本科植物系統(tǒng)分類研究獲得的結果也都有所差異，而基于EF1-a基因對禾本科植物分類的研究少有所見.作者對水稻、小麥、大麥(Hordeumvulgare)、玉米、芒(Miscanthussinensis)、發(fā)草(Deschampsiaantarctica)等禾本科植物的EF1-a基因核苷酸和氨基酸序列進行比對分析，構建分子系統(tǒng)進化樹.旨在進一步了解禾本科植物之間的進化親緣關系，為禾本科植物種屬間的分類提供確切的分子生物學依據.

1 材料和方法

1.1 材料

本文中所有EF1-a序列信息來自NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/).

本研究所用植物材料如下：水稻(OryzasativaL.)、小麥(TriticumaestivumL.)、玉米(ZeamaysL.)、大麥(Hordeumvulgare)、芒(Miscanthussinensis)、發(fā)草(Deschampsiaantarctica)、大豆(Glycinemax).

1.2 方法

利用NCBI中的BLAST軟件對6種禾本科植物的EF1-a基因序列進行同源性比對.運用Clustal X version 1.8分析軟件[9]，參數設為默認值, 對28個基因序列進行多重對比并人工校正.利用MEGA 5.0構建分子系統(tǒng)進化樹[10].ME、NJ、UPGMA分子系統(tǒng)進化樹均采用軟件中的默認參數.

2 結果與分析

2.1 核苷酸和氨基酸序列的相似性

稻屬中9個EF1-a核苷酸序列之間的相似值達到95%以上，而氨基酸序列之間的相似值達到99%以上；玉米屬中15個EF1-a核苷酸序列之間的相似值多數在90%左右，但也出現了84%左右的低相似值，氨基酸序列之間的相似值相比于水稻也略顯低些.研究表明，水稻EF1-a基因核苷酸序列相似性普遍較高，玉米相似性存在差異，但是氨基酸序列的相似性高于核苷酸序列的相似性，研究結果支持禾本科植物EF1-a氨基酸序列保守的觀點[11].

2.2 多重序列比對分析

對6種禾本科植物28個EF1-a基因核苷酸序列和氨基酸序列進行多重序列比對分析，結果表明：核苷酸序列同源性高，氨基酸序列比核苷酸序列的同源性更高，所以氨基酸序列比較適合分子系統(tǒng)發(fā)育重建.

2.3 分子系統(tǒng)進化樹分析

用gi|xxxxx代表NCBI中不同的EF1-a基因序列的編號，利用ME法構建核苷酸分子系統(tǒng)進化樹，結果見圖1.6種禾本科植物被分為4個組群，引自水稻屬的9個核苷酸序列材料聚為一支，靴帶支持率100%；引自小麥和大麥的2個序列材料聚在一起，靴帶支持率100%，它們的親緣關系更近；引自發(fā)草的材料聚為一類；引自玉米的15個材料在聚為一個組群的前提下又分為兩個組群，其中引自芒的一個材料與玉米組群中的第二個組群聚為一類.

利用NJ法對核苷酸序列構建分子系統(tǒng)進化樹，結果見圖2.來自水稻的9個氨基酸序列聚為一支，靴帶支持率100%；來自小麥和大麥的兩個核苷酸序列聚為一支，節(jié)點支持率100%；來自水稻和麥屬的材料聚在一起，親緣關系較近；引自玉米的核苷酸序列在聚為一個組群的前提下又聚為兩類，其中引自芒的材料聚在玉米的第二個類群中，表現出一定的親緣關系；發(fā)草材料單獨聚為一個類群.

利用ME法對氨基酸序列構建分子系統(tǒng)進化樹，結果見圖3.引用材料被聚類分為三大類群，來自水稻的9個氨基酸序列聚為一類，靴帶支持率98%；來自小麥、大麥的兩個氨基酸序列聚為一類，靴帶支持率100%，然后與發(fā)草聚在一起，靴帶支持率53%；引自玉米的材料被聚類分為兩個大類，靴帶支持率分別為90%、65%，其中在第二個大類中，芒以靴帶支持率63%聚在其中.

利用NJ法對氨基酸序列構建分子系統(tǒng)進化樹，結果見圖4.來自水稻的氨基酸序列聚為一類，靴帶節(jié)點支持率98%；來自小麥、大麥的氨基酸序列聚為一類，靴帶支持率100%，然后與發(fā)草聚為一個類群；來自玉米的氨基酸序列聚為一支，靴帶支持率54%，然后被聚為兩個類群.來自芒的序列插在其中.

利用UPGMA法對氨基酸序列構建分子系統(tǒng)進化樹，結果見圖5.來自水稻的9個序列聚在一支，靴帶支持率96%；來自小麥和大麥的序列也聚在一支，靴帶支持率100%；而玉米的氨基酸序列分布在不同分支，分析價值不高，但是其他的物種聚類明顯.因此，此種方法運用在禾本科植物氨基酸序列的聚類分析還有待進一步的研究.

利用UPGMA法對核苷酸序列構建分子系統(tǒng)進化樹，結果見圖6.核苷酸序列被聚類分析分為四大分支，引自發(fā)草的材料單獨聚為一類；引自水稻和麥屬的材料聚為一個大類，然后麥屬和水稻各自聚在一起；引自玉米的材料被聚為了兩個大類，而芒聚在了其中一個大類里面.

通過對核苷酸和氨基酸序列構建的分子系統(tǒng)進化樹進行比較分析，得出以下結論:利用核苷酸序列構建的3種進化樹都能準確反映禾本科植物的分類地位和親緣關系，并且與傳統(tǒng)的分類基本吻合.利用氨基酸序列構建的ME樹和NJ樹也能反映禾本科植物的分類地位和親緣關系，但構建的UPGMA樹對玉米的分類準確性不高，原因可能是與玉米亞種較多，基因具有多態(tài)性有關.因此核苷酸序列構建的系統(tǒng)進化樹更適合于屬間的聚類進化分析，而氨基酸序列保守性高，更適合于種間的系統(tǒng)進化分析，3種構建方法以UPGMA法對亞種間的細化分類最為合適.

圖1 基于EF1-a核苷酸序列構建的ME樹Fig.1 ME tree established on the basis of EF1-a cDNA sequences

圖2 基于EF1-a核苷酸序列構建的NJ樹Fig.2 NJ tree established on the basis of EF1-a cDNA sequences

圖3 基于EF1-a氨基酸序列構建的ME樹Fig.3 ME tree established on the basis of EF1-a amino acid sequences

圖4 基于EF1-a氨基酸序列構建的NJ樹Fig.4 NJ tree established on the basis of EF1-a amino acid sequences

圖5 基于EF1-a氨基酸序列構建的UPGMA樹Fig.5 UPGMA tree established on the basis of EF1-a amino acid sequences

圖6 基于EF1-a核苷酸序列構建的UPGMA樹Fig.6 UPGMA tree established on the basis of EF1-a cDNA sequences

3 討論

核苷酸序列是物種進化的忠實記錄者，直接研究其序列變異可以再現物種進化歷程，為物種系統(tǒng)演化提供有益的線索[12].因此，基于分子水平的系統(tǒng)發(fā)育研究，對于揭示植物系統(tǒng)進化的本質具有重大的意義.作者通過對主要禾本科植物EF1-a的基因序列和氨基酸序列比對分析及構建分子系統(tǒng)進化樹，結果表明EF1-a基因對禾本科植物種屬間分類具有一定的應用價值.植物延伸因子EF1-a廣泛存在于真核細胞內，其表達調控十分保守，與植物細胞的多種生理生殖反應有關.植物種間的EF1-a氨基酸序列高度保守，在種間遺傳進化分析研究中作用顯著，所以其不失為遺傳進化分析的另一種良好材料.可以根據該基因的保守序列克隆某一分類位置有爭議的禾本科植物的EF1-acDNA序列，與已有的禾本科該基因的cDNA共同構建合適的系統(tǒng)進化樹，作為該物種分類的重要參考依據.另外，由于對植物延伸因子的研究不是很完善，本研究的覆蓋面還不是很廣，要達到更完善的程度，需要對植物延伸因子進行更多的研究.

參考文獻：

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