用HPLC柱后衍生法分析煙草中氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘留

邵金良，汪祿祥，劉宏程，蘭珊珊，梅文泉，鄒艷虹，楊 芳

（云南省農(nóng)業(yè)科學院質(zhì)量標準與檢測技術(shù)研究所，昆明 650223）

氨基甲酸酯類農(nóng)藥是以甲酸酯為前體化合物發(fā)展而來的農(nóng)藥，具有分解快、殘留期短、低毒、高效、選擇性強等特點，是繼有機磷之后在煙草種植過程中使用較為廣泛的殺蟲劑和除草劑[1]。農(nóng)藥在保護煙草產(chǎn)品質(zhì)量的同時，其在煙草中的殘留也會對人體造成不同程度的傷害[2]。大多數(shù)氨基甲酸酯類農(nóng)藥施用后在很短的時間內(nèi)就可被降解，降解產(chǎn)物的活性通常與母體化合物相當或更強，毒性甚至更大。例如涕滅威降解后生成的涕滅威亞砜、涕滅威砜的毒性比涕滅威強。因此，在檢測氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘留時，必須同時檢測代謝產(chǎn)物[3]。

目前，關(guān)于氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘留量的分析國內(nèi)外均有報道，檢測方法主要有氣相色譜法（GC）[4]、氣相色譜-質(zhì)譜法(GC-MS)[5]、高效液相色譜法（LC）[6]、高效液相色譜-質(zhì)譜法（LC-MS）[7]等。這些方法各有優(yōu)缺點，由于氨基甲酸酯類化合物極性強，熱穩(wěn)定性較差，使用GC或GC-MS檢測時常采用特殊的技術(shù)或手段以達到準確測定的目的，方法復雜[8]。而用HPLC進行分析，氨基甲酸酯類化合物的紫外吸收較弱，直接檢測靈敏度較低[1]。用高效液相色譜柱后衍生系統(tǒng)、熒光檢測器檢測煙草中氨基甲酸酯類農(nóng)藥時，背景中幾乎不含有帶-CONH-基團的物質(zhì)干擾，很難衍生成具有熒光的物質(zhì)，因此，具有雜質(zhì)干擾小，檢測穩(wěn)定，靈敏度高、重現(xiàn)性好等優(yōu)點[9]。本試驗并優(yōu)化了煙草中涕滅威亞砜、涕滅威砜、滅多威、三羥基克百威、涕滅威、克百威、甲萘威、異丙威等8種農(nóng)藥的樣品前處理方法和高效液相色譜分離檢測條件，對煙草中8種氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘留高效液相色譜（帶熒光檢測器和柱后衍生系統(tǒng)）多殘留檢測方法進行了研究。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

1.1.1 儀器 高效液相色譜儀-熒光檢測器（PerkinElmer 200A）、色譜柱 Waters Symmetry Shield?（C18，5 μm，4.6×250 mm）、回旋式震蕩器（HY-5）、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（RE-52AA）、SPE凈化柱（Florisil-SPE 1 g/6mL；LC-NH2–SPE 500 mg/3mL；C181 g/6mL）、氮吹儀（Organomation Associates）、超純水機（Arium 611）。

1.1.2 試劑 乙腈（AR）、二氯甲烷（AR）、乙腈（HPLC）、甲醇（HPLC）、NaOH溶液、OPA稀釋溶液、鄰苯二甲醛、巰基乙醇、涕滅威亞砜、涕滅威砜、滅多威、三羥基克百威、涕滅威、克百威、甲萘威、異丙威等8種農(nóng)藥標準品（1000.0 mg/L農(nóng)業(yè)部環(huán)境保護科研監(jiān)測所生產(chǎn)）。

1.2 樣品的處理與分析

1.2.1 樣品處理 稱取5.0 g煙葉樣品于250 mL磨口三角瓶中，加入100 mL乙腈:水（1:1，V/V）按文獻[10]步驟進行提取。用 2 mL甲醇:二氯甲烷（1:99，V/V）溶解樣品，待凈化。凈化用NH2-SPE柱。5 mL二氯甲烷:甲醇（1:99，V/V）預淋洗，棄去淋出液，將上述2 mL二氯甲烷:甲醇溶液轉(zhuǎn)入柱中，用6 mL甲醇:二氯甲烷（1:99，V/V）淋洗SPE柱，收集淋出液，40 ℃氮吹濃縮至近干，用2 mL甲醇定容，經(jīng)0.22 μm有機相濾膜過濾，待測定。

1.2.2 色譜條件 流動相：乙腈/水(0～8 min，25:75，V/V；8～25 min，45:55，V/V；25～28 min，25:75，V/V) ；流速1.0 mL/min；測定波長Ex=339 nm，Em=445 nm；柱溫30.0 ℃；進樣量：10.0 μL；柱后衍生條件：0.05 mol/L NaOH 溶液，流速0.30 mL/min；OPA試劑，流速0.30 mL/min；衍生溫度80 ℃。

1.2.3 保留時間 涕滅威亞砜 4.28～4.34 min，涕滅威砜5.55～5.70 min，滅多威6.42～6.55 min，三羥基克百威 9.01～9.21 min，涕滅威 15.24～15.45 min，克百威 18.50～18.81 min，甲萘威 20.03～20.50 min，異丙威22.85～23.34 min。

2 結(jié)果與討論

2.1 線性關(guān)系和檢出限

取一定量的氨基甲酸酯混標準母液，稀釋成濃度分別為0.02，0.2，1.0，5.0，10.0 mg/kg的氨基甲酸酯標準曲線工作液，按上述方法提取，凈化和測定，繪制標準曲線[11]。8種氨基甲酸酯農(nóng)藥的線性范圍、回歸方程、相關(guān)系數(shù)及檢出限見表 1，相關(guān)圖譜見圖1～3。

2.2 添加回收率與相對標準偏差

以干煙葉為對照樣品，分別添加3個不同濃度的8種氨基甲酸酯農(nóng)藥標準品溶液，每個樣品重復5次，按上述方法提取、凈化和檢測。表2可見，樣品加標濃度為 0.05 mg/kg時，平均回收率為80.8%～110.6%，相對標準偏差為 3.2%～10.8%；0.1 mg/kg時，平均回收率為84.4%～109.7%，相對標準偏差為3.8%～11.8%；0.5 mg/kg時，平均回收率為 81.6%～112.9%，相對標準偏差為 3.7%～8.5%。

圖1 煙葉對照色譜圖Fig.1 Chromatogram of tobacco blank

圖2 煙葉加標色譜圖（0.1 mg/kg）Fig.2 Chromatograms of tobacco sample spiked at 0.1 mg/kg of each pesticide

圖3 8種氨基甲酸酯色譜圖（0.1 mg/L）Fig.3 Chromatogram of 8 carbamate pesticides

表1 8種氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘留的回歸方程、相關(guān)系數(shù)Table1 Linearity and limits of detection of the 8 carbamate pesticides

2.3 最佳操作條件的選擇

2.3.1 提取溶劑的選擇 在氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘留分析中常用的提取溶劑有乙腈、丙酮、二氯甲烷、石油醚、乙酸乙酯、甲醇等[12]。分別選擇甲醇:水（1:1，V/V）、乙腈:水（1:1，V/V）、丙酮:水（1:1，V/V）、乙酸乙酯:水（1:1，V/V）作為提取溶劑，相同試驗條件下，加標濃度為0.1 mg/kg。試驗結(jié)果表明（圖4），使用丙酮:水（1:1，V/V）的平均回收率為 61.8%，乙酸乙酯:水（1:1，V/V）為67.5%，其回收率明顯低于甲醇:水（1:1，V/V）的81.3%和乙腈:水（1:1，V/V）的 94.1%。而用乙腈:水（1:1，V/V）提取的樣品基質(zhì)干擾較小，考慮到綜合提取效率、選擇性、溶劑化作用和滲透能力等因素，本方法采用乙腈:水（1:1，V/V）作為提取溶劑。以1:1比例的乙腈/水提取后再以 10%氯化鈉溶液和二氯甲烷萃取，能更好的避免將色素、焦油及水溶性雜質(zhì)提取出來，使提取液更潔凈，無較大干擾峰[13]。

2.3.2 固相萃取柱的選擇 煙草是含有大量脂肪、色素、多糖等大分子組分的復雜基質(zhì)[13]。對于極性較大的氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘留的分析，采用液-液分配法凈化后，回收率往往很低，有一定的局限性，目前多采用固相萃取技術(shù)進行凈化，具有操作步驟少，溶劑用量少等優(yōu)點。本文考察氟羅里硅柱、C18柱、氨基固相萃取柱的凈化效果。在煙葉中添加已知量的氨基甲酸酯農(nóng)藥標準品，8種氨基甲酸酯農(nóng)藥經(jīng)氟羅里硅土柱凈化，回收率只有65.0%，而經(jīng)C18和氨基固相萃取柱凈化，回收率有95.0%。實際樣品測定時，C18固相萃取柱凈化，存在部分干擾；氨基固相萃取柱能有效地吸附有機酸和糖分，回收率高且沒有干擾。

表2 煙草氨基甲酸酯類農(nóng)藥加標回收率和重復性試驗結(jié)果（n=5）Table2 Recoveries and coefficient variations of 8 carbamate pesticides

2.3.3 洗脫液配比和洗脫體積的選擇 氨基固相萃取柱經(jīng)活化后，取 8種農(nóng)藥的混合標樣（0.25 mg/L）1 mL上樣，平行3份，分別用甲醇:二氯甲烷（1:99，V/V），甲醇:二氯甲烷（3:97，V/V），甲醇：二氯甲烷（5:95，V/V）及甲醇:二氯甲烷（7:93，V/V）等4種溶液洗脫。甲醇體積分數(shù)為1%～7%時，8種氨基甲酸酯的回收率基本穩(wěn)定，隨著甲醇用量增加雜質(zhì)峰也明顯增多，因此選擇甲醇:二氯甲烷（1:99，V/V）作為洗脫溶液。在優(yōu)選洗脫劑配比的基礎(chǔ)上，進一步篩選洗脫劑用量對回收率的影響，結(jié)果表明，前4 mL洗脫液對回收率的影響最大，當洗脫液體積達到8 mL時，繼續(xù)增大洗脫液用量，對8種氨基甲酸酯的回收率沒有影響。

2.3.4 流動相的選擇 為了獲得最佳分離效果，分別考察了乙腈、水及甲醇、水溶液作流動相時的分離情況；分別考察等度和梯度洗脫條件對分離效果的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，甲醇+水，乙腈+水可以實現(xiàn)氨基甲酸酯類農(nóng)藥的有效分離，當乙腈+水體系作為流動相時，待測物氨基甲酸酯類農(nóng)藥的響應(yīng)信號較強，分離效果更好。而甲醇+水體系流動相的極性雜質(zhì)較多，個別峰形不理想，干擾較大，響應(yīng)信號較低，故選擇乙腈+水體系作為流動相。

淋洗條件試驗結(jié)果表明，乙腈相配比越大，出峰越快，峰形越好，但分離度較差；水相配比加大，分離度提高，但峰型寬，分析時間長。當乙腈體積分數(shù)從25%線性遞增至45%并保持不變時，隨著洗脫能力增強，涕滅威、克百威、甲萘威和異丙威依次流出，峰面積信號也最強，且前者的峰形更對稱。為了使8種氨基甲酸酯類農(nóng)藥既能在盡量短的時間內(nèi)完全分離，又能得到峰型較好的色譜峰，經(jīng)實驗確定最佳梯度洗脫條件見表 3。采用該色譜條件可使8種氨基甲酸酯類農(nóng)藥完全分離并能大大縮短分析時間。

2.4 實際樣品分析

應(yīng)用建立的高效液相色譜-柱后衍生熒光分析方法，測定了12個煙草樣品中8種氨基甲酸酯類農(nóng)藥的殘留量，均未檢出氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘留。

表3 8種氨基甲酸酯類農(nóng)藥梯度洗脫條件Table3 Gradient elution conditions of 8 carbamate pesticides

3 結(jié) 論

本研究建立了一種快速測定煙草中氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘留的高效液相色譜-柱后衍生熒光定量方法，在25 min內(nèi)可同時完成煙草中涕滅威亞砜、涕滅威砜、滅多威、三羥基克百威、涕滅威、克百威、甲萘威、異丙威等8種氨基甲酸酯農(nóng)藥的分析測定。本方法具有多種農(nóng)殘同時提取、凈化，準確度高、重現(xiàn)性好等優(yōu)點，可用于煙草中多種氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘留的分析。

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