P物質(zhì)和降鈣素基因相關(guān)肽在骨癌痛-嗎啡耐受模型中的表達(dá)

司馬蕾 厲建春 蔡淑呈 劉波濤 樊碧發(fā)

衛(wèi)生部中日友好醫(yī)院全國(guó)疼痛診療研究中心，北京 100029

P物質(zhì)和降鈣素基因相關(guān)肽在骨癌痛-嗎啡耐受模型中的表達(dá)

司馬蕾 厲建春 蔡淑呈 劉波濤 樊碧發(fā)

衛(wèi)生部中日友好醫(yī)院全國(guó)疼痛診療研究中心，北京 100029

背景與目的：多數(shù)晚期癌癥患者會(huì)經(jīng)歷中重度癌痛折磨。阿片藥物是癌痛治療最常用和最有效的藥物，但長(zhǎng)時(shí)間使用容易造成耐受甚至痛覺(jué)過(guò)敏。P物質(zhì)(substance P，SP)和降鈣素基因相關(guān)肽(calcitonin gene-related peptide，CGRP)是疼痛信號(hào)傳遞中最重要的神經(jīng)遞質(zhì)，但在癌痛-阿片耐受中的表達(dá)尚不清楚。本研究擬在骨癌痛-嗎啡耐受大鼠模型上，探討SP和CGRP在背根神經(jīng)節(jié)(dorsal root ganglion，DRG)水平的表達(dá)特點(diǎn)。方法：60只Wistar大鼠鞘內(nèi)置管成功后，隨機(jī)分為3組：假手術(shù)組、嗎啡耐受組和骨癌痛-嗎啡耐受組。嗎啡耐受組和骨癌痛-嗎啡耐受組分別以熱滅活Walker256乳腺癌細(xì)胞和Walker256乳腺癌細(xì)胞制備脛骨癌痛模型，接種后10 d時(shí)鞘內(nèi)注射嗎啡20 μg/kg。動(dòng)物行為學(xué)測(cè)試使用Von Frey纖維絲，于不同時(shí)間點(diǎn)測(cè)定機(jī)械刺激引起的機(jī)械縮足閾值。研究結(jié)束時(shí)，免疫組織化學(xué)分析DGR中SP和CGRP的表達(dá)，測(cè)定積分光密度IOD值。結(jié)果：行為學(xué)證實(shí)，嗎啡耐受組和骨癌痛-嗎啡耐受組在嗎啡治療第5天時(shí)出現(xiàn)耐受，骨癌痛-嗎啡耐受組縮足閾值較嗎啡耐受組和對(duì)照組明顯降低(P<0.001)。骨癌痛-嗎啡耐受組SP和CGRP積分光密度值IOD(9 917.9±2 246.1和15 021.5±2 989.7)較嗎啡耐受組(5 191.7±1 052.6和9 737.1±2 239.8)和對(duì)照組(4 821.6±843.1和8 180.3±1 242.2)明顯增加(P<0.001)。結(jié)論：SP和CGRP在癌痛-嗎啡耐受大鼠模型DRG中表達(dá)增強(qiáng)，提示這兩種神經(jīng)遞質(zhì)參與了耐受產(chǎn)生，這將為新藥治療癌痛-嗎啡耐受提供更符合臨床的科學(xué)依據(jù)。

P物質(zhì)；降鈣素基因相關(guān)肽；嗎啡耐受；骨癌痛

最新統(tǒng)計(jì)表明，目前全球每年新增癌癥患者1 270萬(wàn)，每年癌癥死亡人數(shù)760萬(wàn)［1］，56%晚期患者經(jīng)歷至少1個(gè)月的中重度癌痛折磨［2］。阿片藥物是癌痛治療最常用和最有效的藥物，但長(zhǎng)時(shí)間或大劑量使用容易造成耐受甚至痛覺(jué)過(guò)敏［3-4］。由于目前尚沒(méi)有比阿片更有效的鎮(zhèn)痛藥物，阿片耐受成為癌痛治療中最亟待解決的問(wèn)題。

背根神經(jīng)節(jié)(dorsal root ganglion，DRG)是感覺(jué)神經(jīng)傳入的第一級(jí)神經(jīng)元，其中的中等細(xì)胞和小細(xì)胞分別發(fā)出Aδ和C神經(jīng)纖維，介導(dǎo)疼痛傳導(dǎo)。P物質(zhì)(substance P，SP)和降鈣素基因相關(guān)肽(calcitonin-gene related peptide，CGRP)是疼痛傳導(dǎo)過(guò)程中最重要的神經(jīng)遞質(zhì)。阿片藥物發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用的機(jī)制是減少SP和CGRP等神經(jīng)遞質(zhì)自Aδ和C神經(jīng)纖維末梢的突觸前膜向突觸間隙的釋放［5］。疼痛神經(jīng)遞質(zhì)在阿片耐受中的表達(dá)變化尚不十分清楚，直接影響了耐受的治療。

藥理學(xué)定義耐受是指連續(xù)用藥產(chǎn)生的藥物反應(yīng)性降低。本研究擬在高度模擬臨床病理的骨癌痛大鼠模型上，以最常使用的嗎啡為阿片藥物代表，探討神經(jīng)遞質(zhì)SP和CGRP在癌痛-嗎啡耐受模型中的表達(dá)變化。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組

Wistar大鼠雌性60只(北京維通利華動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供)，SPF(specific pathogen free condition)級(jí)，合格證號(hào)SCXK9(京)2007-0001，體質(zhì)量約(210±20) g。參照張亞軍等［6］介紹的方法進(jìn)行動(dòng)物造模。腰3~腰4間隙穿刺，鞘內(nèi)置入PE-10導(dǎo)管，置管后24 h無(wú)運(yùn)動(dòng)障礙的大鼠，經(jīng)導(dǎo)管注射2%利多卡因10 mL，30 s內(nèi)大鼠發(fā)生雙后肢麻痹，表明鞘內(nèi)置管成功。置管后5 d進(jìn)行分組處理。分組采用隨機(jī)數(shù)字表法，將鞘內(nèi)置管成功的60只大鼠隨機(jī)分為3組：假手術(shù)組、嗎啡耐受組和骨癌痛-嗎啡耐受組，每組20只。

1.2 骨癌痛模型的制備及嗎啡給藥

Walker256乳腺癌細(xì)胞購(gòu)自協(xié)和醫(yī)科大學(xué)腫瘤研究所。取雌性幼鼠2只，體質(zhì)量60~80 g，日齡21 d，腹腔注射癌細(xì)胞0.5 mL(細(xì)胞濃度為4×104/μL)，7 d時(shí)收集腹水，以無(wú)菌0.01 mol/L PBS漂洗細(xì)胞3次，細(xì)胞濃度調(diào)整至4×102/μL的濃度備用。在水中煮沸10 min制備熱滅活的癌細(xì)胞備用。嗎啡耐受組和骨癌痛-嗎啡耐受組參照文獻(xiàn)［7］介紹的方法制備脛骨癌痛模型，骨癌痛-嗎啡耐受組右側(cè)脛骨上段骨髓腔注入Walker256乳腺癌細(xì)胞10 μL，嗎啡耐受組注射熱滅活的Walker256癌細(xì)胞10 μL，假手術(shù)組僅暴露右側(cè)脛骨上段。接種后10 d時(shí)嗎啡耐受組和骨癌痛-嗎啡耐受組鞘內(nèi)注射嗎啡2 0 μ g/k g(購(gòu)自沈陽(yáng)第一制藥廠，批號(hào)H21022436)，嗎啡用0.9%NaCl溶液稀釋至100 μL，假手術(shù)組給予等容量0.9%NaCl溶液，每天2次(8:00 A.m.和6:00 P.m.)，連續(xù)9 d。

1.3 機(jī)械痛閾測(cè)定

嗎啡耐受與神經(jīng)病理性疼痛的痛行為學(xué)表現(xiàn)相似，其機(jī)制均與中樞敏化有關(guān)，痛覺(jué)過(guò)敏是慢性神經(jīng)病理性疼痛的主要行為學(xué)特征，痛閾較基礎(chǔ)值明顯降低提示出現(xiàn)痛覺(jué)過(guò)敏［8］。本研究采用up and down方法［9］連續(xù)測(cè)定機(jī)械痛閾，將大鼠置于金屬網(wǎng)上，蓋以透明的有機(jī)玻璃罩，先讓大鼠適應(yīng)環(huán)境15 min，待梳理探究活動(dòng)基本消失后，用一系列標(biāo)準(zhǔn)化的Von Frey纖維絲(購(gòu)自美國(guó)North Coast Medical公司)刺激右后肢足底中心部位。刺激從2 g開(kāi)始，最大力度15 g，根據(jù)公式推算出50%縮足閾值(50% paw withdrawal threshold，50%PWT)。測(cè)定時(shí)間分別是接種癌細(xì)胞前(T0)，癌細(xì)胞接種第l、3、6、9天(T1、T3、T6、T9)、給予嗎啡第1、3、5、7、9天(M1、M3、M5、M7、M9)，每次于16時(shí)左右進(jìn)行測(cè)定，共10次。

1.4 骨質(zhì)破壞檢查

接種后分別于第1 、9 、15 天(T1、T9、T15)行為學(xué)測(cè)定后，采用500 mA X線機(jī)(購(gòu)自德國(guó)Simens公司)行右后肢放射學(xué)檢查，進(jìn)行骨質(zhì)破壞檢查。

1.5 免疫組織化學(xué)檢測(cè)DGR中SP和CGRP積分光密度(integral optical density，IOD)

選擇M9時(shí)行為學(xué)測(cè)試完畢后，將大鼠在深麻醉下快速斷頭取一側(cè)L4-L5 DRG，置于4%濃度的多聚甲醛磷酸鹽緩沖液固定，脫水，石蠟包埋，沿縱軸取最大縱切面連續(xù)切片20張，片厚約6 μm。多克隆兔抗CGRP抗體(1∶500，DAKO)4 ℃溫育24 h，滴加二抗室溫溫育4 h，DAB顯色20 min。多克隆兔抗體SP一抗(1∶5 000，DAKO)溫育24 h，通用型二抗(DAKO)室溫溫育2.5 h，DAB顯色2 min。BX51正置光學(xué)顯微鏡(Olympus)下每張切片隨機(jī)取5個(gè)視野，采用Image Pro-Plus 5.0圖像分析軟件半定量測(cè)定SP和CGRP的IOD。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)的處理、作圖、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析等運(yùn)用Microsoft Exce1 2000、SPSS 10.0軟件進(jìn)行。數(shù)據(jù)以表示，兩組間差異應(yīng)用t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 骨癌痛-嗎啡耐受模型機(jī)械痛閾變化

動(dòng)物行為學(xué)證實(shí)，骨癌痛-嗎啡耐受組接種癌細(xì)胞第6天出現(xiàn)明顯痛閾降低(與假手術(shù)組和嗎啡耐受組比較，P<0.001)，給予嗎啡治療后疼痛立即緩解，50%PWT增高。嗎啡耐受組和骨癌痛-嗎啡耐受組在嗎啡治療第5天時(shí)出現(xiàn)耐受，骨癌痛-嗎啡耐受組較嗎啡耐受組50%PWT下降更顯著(P<0.001，圖1)。

2.2 骨癌痛-嗎啡耐受模型骨質(zhì)破壞

放射影像學(xué)結(jié)果顯示：癌痛-嗎啡耐受組大鼠脛骨破壞存在，且呈動(dòng)態(tài)進(jìn)展。癌細(xì)胞接種9 d后出現(xiàn)骨皮質(zhì)與骨小梁分離，15 d后腫脹破壞更為明顯(圖2)。

2.3 骨癌痛-嗎啡耐受模型CGRP和SP表達(dá)變化

免疫組化分析：在光鏡下觀察，含有CGRP和SP的細(xì)胞呈深棕染色，分布于DRG邊緣。骨癌痛-嗎啡耐受組SP的IOD為9 917.9±2 246.1，較嗎啡耐受組(5 191.7±1 052.6)和對(duì)照組(4 821.6±843.1)明顯增加(P<0.001)。CGRP的IOD為15 021.5±2 989.7，較嗎啡耐受組(9 737.1±2 239.8)和對(duì)照組(8 180.3±1 242.2)明顯增加(P<0.001)。嗎啡耐受組SP和CGRP與對(duì)照組相比也分別有所增加(P<0.05，圖3、4、5)。

3 討 論

目前國(guó)內(nèi)外關(guān)于阿片耐受的研究幾乎全部基于單純嗎啡耐受動(dòng)物模型，并非以癌痛病理狀態(tài)為基礎(chǔ)，與臨床狀況并不相符。研究證明，炎性痛模型并不易產(chǎn)生嗎啡耐受［10］。骨癌痛是臨床最常見(jiàn)和最頑固的癌痛類(lèi)型，骨癌痛的大鼠模型能夠高度模擬臨床病理，是癌痛研究的理想模型。嗎啡是最常使用的阿片藥物，對(duì)阿片耐受的研究多以嗎啡耐受為代表。

本研究在骨癌痛-嗎啡耐受大鼠模型上證實(shí)，鞘內(nèi)連續(xù)用嗎啡5 d后大鼠出現(xiàn)機(jī)械痛閾增高，痛覺(jué)過(guò)敏，說(shuō)明癌痛容易產(chǎn)生嗎啡耐受，這與臨床的現(xiàn)狀是一致的［4］。癌痛-嗎啡耐受發(fā)生的時(shí)間點(diǎn)與單純嗎啡耐受相似，同時(shí)由于骨癌痛本身劇烈疼痛特征，其機(jī)械刺激痛閾較單純嗎啡耐受組更低。

本研究免疫組化結(jié)果顯示，嗎啡耐受和骨癌痛-嗎啡耐受大鼠DRG中SP和CGRP陽(yáng)性胞體數(shù)目增多和染色加深，IOD值明顯升高，說(shuō)明SP和CGRP參與了嗎啡耐受的產(chǎn)生。而Thomson等［11］指出嗎啡耐受大鼠脊髓背角SP免疫活性降低，可能疼痛遞質(zhì)在脊髓背角(中樞神經(jīng))和DRG(周?chē)窠?jīng))變化不盡相同。當(dāng)疼痛刺激或長(zhǎng)時(shí)間的嗎啡處理，SP和CGRP在DRG水平釋放發(fā)生適應(yīng)性增加，可能與delta阿片受體激活后插入細(xì)胞表面引發(fā)疼痛介質(zhì)大量合成釋放有關(guān)［12-13］，與本研究結(jié)論一致。隨著致痛物質(zhì)神經(jīng)遞質(zhì)從突觸前膜向突出間隙的釋放增多，嗎啡的鎮(zhèn)痛效果被減弱，出現(xiàn)痛覺(jué)過(guò)敏等動(dòng)物行為學(xué)改變。本研究不但證實(shí)嗎啡耐受較對(duì)照組大鼠疼痛遞質(zhì)DRG表達(dá)增加，還證實(shí)骨癌痛-嗎啡耐受較嗎啡耐受大鼠增加更為明顯，說(shuō)明骨癌痛本身可能也會(huì)增加疼痛遞質(zhì)的釋放，當(dāng)嗎啡形成耐受后，不足以抑制疼痛遞質(zhì)的過(guò)度釋放，因而難以發(fā)揮有效鎮(zhèn)痛作用。

在體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，慢性嗎啡處理引起CGRP免疫反應(yīng)性增加，應(yīng)用CGRP受體拮抗劑CGRP8-37可以阻止這種現(xiàn)象的出現(xiàn)［14］。對(duì)已經(jīng)發(fā)生耐受的動(dòng)物，CGRP受體拮抗劑也可以部分恢復(fù)脊髓嗎啡的鎮(zhèn)痛作用。SP以相似的方式調(diào)節(jié)脊髓的嗎啡耐受［15］：慢性嗎啡處理造成背角SP免疫反應(yīng)性增加，NKl受體拮抗劑SRl40333可以抑制并逆轉(zhuǎn)嗎啡耐受。這些研究提示可以在癌痛-嗎啡耐受大鼠體內(nèi)進(jìn)行CGRP或SP受體拮抗劑的相關(guān)研究。

需要注意的是，由于骨癌痛本身病程進(jìn)展，因此骨癌痛-嗎啡耐受模型中，機(jī)械痛閾的下降或是疼痛神經(jīng)遞質(zhì)的過(guò)度表達(dá)，不但與嗎啡耐受相關(guān)，還可能與疾病本身進(jìn)展相關(guān)。如何將混雜的兩個(gè)影響因素加以區(qū)別是一個(gè)難題，也是我們下一步研究的方向。

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Expression of substance P and calcitonin gene-related peptide in bone cancer pain-morphine tolerance rat model

SI-MA Lei, LI Jian-chun, CAI Shu-cheng, LIU Bo-tao, FAN Bi-fa(National Pain Management and Research Center, China-Japan Friendship Hospital, Beijing 100029,China)

SI-MA Lei E-mail：simalei@yahoo.cn

Background and purpose：More than half of the advanced cancer patients suffer from severe pain. Opioid is the overwhelming drug in cancer pain management. But repeated exposure to opioids can lead to tolerance and hyperalgesia. Substance P (SP) and calcitonin gene-related peptide (CGRP) are the key neurotransmitters in pain signaling pathway. The expression of neurotransmitter has been widely investigated in many pain models but poorly explored in cancer pain-opioid tolerance model. This research is to investigate SP and CGRP expression characteristics at dorsal root ganglion (DRG) level in the development of bone cancer pain-morphine tolerance of rat model.Methods：Sixty Wistar rats with successful intrathecal lidocaine were randomly divided into 3 groups (n=20 each): sham group, morphine tolerance group and bone cancer pain-morphine tolerance group. Bone cancer pain were induced by intra-tibia inoculation of Walker256 mammary gland carcinoma cells in bone cancer pain-morphine tolerance group, while in morphine tolerance group heat-inactivated Walkore256 mammary gland carcinoma cells were given instead. Morphine 20 μg/kg was administered intrathecally twice a day for 9 consecutive days 10 days later. The mechanical paw withdrawal threshold (PWT) was measured before inoculation, at day 1, 3, 6 and 9 after inoculation,and at day l, 3, 5, 7 and 9 of morphine administration. The rats were sacrificed after stopping the last stimulus. DRG of L4-L5 segment was isolated to determine the SP-immunoreactivity and CGRP-immunoreactivity expression.Results：PWT was significantly decreased in bone cancer pain-morphine tolerance group 5 days after morphine intrathecal compared with sham group and morphine tolerance group (P＜0.001). The IOD values of SP and CGRP(9 917.9±2 246.1 and 15 021.5±2 989.7) by immunohistochemical methods in bone cancer pain-morphine tolerance group were much higher than that in morphine tolerance group (5 191.7±1 052.6 and 9 737.1±2 239.8) and sham group(4 821.6±843.1 and 8 180.3±1 242.2,P＜0.001, respectively).Conclusion：It suggests that SP and CGRP may play an important role in morphine antinociceptive tolerance by up-regulation in DRG. This research would provide more scientific evidence of new strategy for inhibiting morphine tolerance in cancer pain.

Substance P; Calcitonin gene-related peptide; Morphine tolerance; Bone cancer pain

10.3969/j.issn.1007-3969.2012.08.001

R738.1

A

1007-3639(2012)08-0561-05

司馬蕾 E-mail:simalei@yahoo.cn

2012-03-05

2012-05-16）