吳 鋒，孟國梁，常珊珊，徐濟良

(南通大學醫(yī)學院藥理學教研室，江蘇南通 226001)

靈芝多糖(Ganoderma lucidum Polysaccharide，GLP)為多孔菌科真菌靈芝［Ganoderma lucidum(Leys.Ex Fr.)Karst］中提取出的以 β(1→3)糖苷鍵為主鏈的雜多糖［1］。筆者證實GLP可有效通過調節(jié)脂質代謝紊亂減緩大鼠動脈粥樣硬化(AS)病程［2］，楊麗娟等［3］發(fā)現(xiàn)靈芝多糖肽對人臍靜脈內皮有抗氧化損傷作用，而氧化應激在AS發(fā)生發(fā)展過程中為主因之一［4］;所以本實驗以AS大鼠為實驗模型，觀察GLP能否通過干預AS氧化應激過程起到治療作用，并探討其作用機制，為臨床應用提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1藥品與試劑GLP(江蘇安惠生物科技有限公司，含量82%)，膽固醇(上海藍季科技發(fā)展有限公司)，膽酸鈉(上海藍季科技發(fā)展有限公司)，丙基硫氧嘧啶(上海復星朝暉藥業(yè)有限公司)，維生素D3(上海通用藥業(yè)股份有限公司)，丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)測試盒(南京建成生物工程公司)，活體組織氧化應激活性氧(ROS)初級熒光測定試劑盒(genmed)，兔抗大鼠Nox4多克隆抗體(北京博奧森生物技術有限公司)，兔抗大鼠p22phox多克隆抗體(武漢博士德生物工程有限公司)。

1.2模型制作健康♂SD大鼠40只，體質量180～200 g，南通大學實驗動物中心提供。隨機分為5組:正常對照組(CON)、AS模型組(AS)、GLP低、中、高劑量預防組(GLPL、GLPM、GLPH)。除正常組外其余4組以40 mg·kg－1劑量一次性腹腔注射維生素D3，喂高脂飼料(81.3%基礎飼料、10%豬油、3%膽固醇、0.5%膽酸鈉、5%白糖、0.2%丙基硫氧嘧啶)。造模同時，GLP低、中、高劑量組每日分別以 GLP 125、250、500 mg·kg－1灌胃，正常組和模型對照組給予等量生理鹽水灌胃。

1.3方法

1.3.1血清MDA、SOD檢測實驗12周后大鼠禁食12 h，20%烏拉糖腹腔麻醉，頸動脈插管取血，2 000 r·min－1分離血清，使用測試盒分別測定血清MDA、SOD含量。

1.3.2主動脈HE染色取大動脈(從主動脈弓至腹主動脈分叉處)，以生理鹽水沖洗殘血，用4%多聚甲醛溶液固定，逐級乙醇脫水，石蠟包埋切片，HE染色觀察主動脈內膜情況。

1.3.3主動脈ROS測定手術取出血管，用刀片切碎組織，使用genmed活體組織氧化應激活性氧(ROS)初級熒光測定試劑盒，在激發(fā)波長490 nm，散發(fā)波長520 nm下使用熒光酶標儀檢測。

1.3.4免疫印跡Nox4、p22phox蛋白表達從主動脈弓至腹主動脈分叉處取主動脈，加入含有蛋白酶抑制劑的組織裂解液冰上提取蛋白，BCA法蛋白定量。8%的SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白，電流100 V;300 mA轉膜150 min;含5%脫脂奶粉TBST室溫封閉1 h;分別加Nox4和p22phox一抗4℃過夜;d 2加相應的二抗室溫反應1 h，掃膜并使用imageJ進行灰度分析。

1.4統(tǒng)計學處理利用SPSS11.5統(tǒng)計軟件分析處理數(shù)據，計量資料用±s表示，組間采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK檢驗。

2 結果

2.1大鼠血清MDA、SOD變化與CON組比較，AS組 MDA、SOD明顯升高(P＜0.01)，給藥組MDA、SOD較AS組均明顯下降(P＜0.01)，Tab 1。

Tab 1 Comparison of MDA，SOD levels of serum in rats of each group after 12 weeks’administration(±s，n=8)

Tab 1 Comparison of MDA，SOD levels of serum in rats of each group after 12 weeks’administration(±s，n=8)

*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs CON;##P ＜0.01 vs AS

Group MDA/μmol·L－1 SOD/NU·ml －1 CON 6.2 ±1.0## 160.23 ±32.58##AS 10.3 ±2.1* 206.01 ±39.34＊＊GLPL 8.7 ±0.9*## 178.04 ±15.23*##GLPM 7.1 ±1.2*## 170.85 ±23.07*##GLPH 7.3 ±1.6*## 174.57 ±33.78*##

2.2大鼠動脈粥樣斑塊改變如Fig 1所示，正常對照組大鼠胸、腹主動脈壁結構完整，層次清晰，內膜連續(xù)而光滑，中層平滑肌層均勻無萎縮;動脈粥樣硬化模型組血管壁內皮脫落，內膜增厚，內皮下間隙增寬，內彈力板斷裂，斑塊內含有大量泡沫細胞、平滑肌細胞、巨噬細胞，纖維組織增生伴片狀鈣化，中膜平滑肌明顯萎縮;GLP預防組內皮細胞部分脫落，結構較完整，有少量脂質沉積，少見內彈力板斷裂。

Fig 1 HE staining of aorta(×400)

2.3主動脈ROS含量變化如Fig 2所示，AS組大鼠主動脈ROS含量明顯增高;與AS組比較，GLP各給藥組主動脈ROS含量均明顯下降(P＜0.01)。

2.4主動脈Nox4、p22phox表達變化如Fig 3免疫印跡結果顯示，AS組Nox4、p22phox蛋白表達量均較CON組增高(P＜0.01)，GLP干預后目的蛋白表達量明顯下降(P＜0.01)。

Fig 2 Ratio of aorta ROS’s optical density(±s，n=8)

Fig 3 Westen blot of vascular Nox4 and p22phox in rats of each group(±s，n=3)

3 討論

食餌性實驗AS動物模型通常用于模擬AS早期病變，病變首先呈現(xiàn)于主動脈［5］，實驗大鼠12周后形態(tài)學檢測大鼠主動脈顯示AS模型成立。血清中氧化應激指標MDA水平AS組較CON組明顯增高，MDA是ROS攻擊細胞膜多不飽和脂肪酸形成的脂質過氧化物，間接反映ROS的生成量和對組織損傷的程度［6］;結合主動脈ROS試劑盒檢測，均提示AS狀態(tài)下機體可能存在抗氧化防御機制的下降和體內ROS生成的增多。靈芝多糖藥理學研究證實具有多種生物活性和藥理作用，除了主要的免疫調節(jié)和抗腫瘤作用外，Zhao等［7］報道GLP可以通過抑制氧化應激減少大鼠皮層原代神經元缺氧/復氧損傷，楊麗娟等［3］也發(fā)現(xiàn)靈芝多糖肽對人臍靜脈內皮有抗氧化損傷作用，我們證實GLP具備減緩大鼠氧化應激反應阻遏主動脈粥樣硬化病程進展的作用。

目前認為SOD是體內有效清除ROS的天然抗氧化酶［8］，實驗發(fā)現(xiàn)AS模型組SOD血清含量較正常組明顯上調，可解釋為病程中ROS增多后抗氧化酶的合成分泌在一定時程內代償性增加，但實驗中提示這一代償機制不足以消除體內積聚的過多ROS。GLP能夠有效降低主動脈ROS水平和血清MDA值，說明GLP可能是通過減少ROS的生成途徑阻遏動脈粥樣硬化病程。

NADPH氧化酶目前被認為是血管內生成ROS的主要酶體，NADPH氧化酶參與了AS的發(fā)生和發(fā)展全過程［9］。NADPH氧化酶，包含胞膜成分細胞色素b558(gp91phox和p22phox)和胞質成分p47phox、p67phox及小的 GTP結合蛋白 rac等5個亞組分［10］，其中p22phox在各種細胞中都高表達。近年來至少發(fā)現(xiàn)了兩種新的gp91phox同工酶家族即Nox和 DUOX，Nox家族有 Nox1、Nox2(gp91phox)、Nox3、Nox4、Nox5等成員;在血管細胞中，內皮細胞和平滑肌細胞主要表達 Nox1和 Nox4。Sorescu等［11］發(fā)現(xiàn)在動脈粥樣硬化患者體內，冠脈斑塊肩部存在大量過氧化物沉積，同時增高的 p22phox和 Nox2(gp91phox)結合后主要位于斑塊中的巨噬細胞，Nox4定位于血管平滑肌和內皮細胞。血管生理學認為，Nox家族是血管ROS的主要來源，并且血管平滑肌的NADPH氧化酶活性主要依賴于Nox4的表達［12－13］。血管平滑肌的分化表型在動脈粥樣硬化病理過程中起關鍵作用，Clempus等［14］Nox家族中只有Nox4在血管平滑機分化過程中起決定作用。我們實驗發(fā)現(xiàn)GLP藥物干預能夠有效下調主動脈p22phox和Nox4蛋白表達，這可能是GLP能夠下調AS大鼠主動脈ROS水平，起到防治動脈粥樣硬化作用的主要原因，但詳細機制有待進一步研究。

［1］Huang S Q，Li J W，Li Y Q，Wang Z.Purification and structural characterization of a new water-soluble neutral polysaccharide GLPF1-1 from Ganoderma lucidum［J］.Int J Biol Macromol，2011，48(1):165－9.

［2］吳 鋒，孟國梁，楊麗云，等.靈芝多糖預防大鼠動脈粥樣硬化的實驗研究［J］.南通大學學報(醫(yī)學版)，2008，341(10):709－17.

［2］Wu F，Meng G L，Yang L Y，et al.Preventive effect of Ganoderma lucidum polysaccharides on formation of atherosclerosis in experimental rats［J］.J Nantong Univ(Med Sci)，2008，341(10):709－17.

［3］楊麗娟，游育紅，林志彬，等.靈芝多糖肽對人臍靜脈內皮細胞氧化損傷的保護作用［J］.中國藥理學通報，2010，26(5):657－60.

［3］Yang L J，You Y H，Lin Z B，Guo Z J，et al.Protective effects of ganoderma lucidum polysaccharides peptide on human umbilical vein endothelial cells injury by reactive oxygen species［J］.Chin Pharmacol Bull，2010，26(5):657 －60.

［4］Liu S X，Hou F F，Guo Z J，et al.Advanced oxidation protein products accelerate atherosclerosis through promoting oxidative stress and inflammation［J］.Arterioscler Thromb Vasc Biol，2006，26(5):1156－62.

［5］徐叔云，卞如濂，陳 修，主編.藥理實驗方法學［M］.第3版.北京:人民衛(wèi)生出版社，2002:1202－4.

［5］Xu S Y，Bian R L，Chen X，chief editor.Pharmacology experiment methodology［M］.3rd ed.Beijing:People’s Medical Publishing House，2002:1202 －4.

［6］Duryee M J，Klassen L W，Schaffert C S，et al.Malondialdehydeacetaldehyde adduct is the dominant epitope after MDA modification of proteins in atherosclerosis［J］.Free Radic Biol Med，2010，49(10):1480－6.

［7］Zhao H B，Lin S Q，Liu J H，Lin Z B.Polysaccharide extract isolated from ganoderma lucidum protects rat cerebral cortical neurons from hypoxia/reoxygenation injury［J］.J Pharmacol Sci，2004，95:294－8.

［8］Zawadzka-Bartczak E.Activities of red blood cell anti-oxidative enzymes(SOD，GPx)and total anti-oxidative capacity of serum(TAS)in men with coronary atherosclerosis and in healthy pilots［J］.Med Sci Monit，2005，11(9):CR440 －4.

［9］Violi F，Basili S，Nigro C，Pignatelli P.Role of NADPH oxidase in atherosclerosis［J］.Future Cardiol，2009，5(1):83 － 92.

［10］Brown D I，Griendling K K.Nox proteins in signal transduction［J］.Free Radic Biol Med，2009，47(9):1239 －53.

［11］Sorescu D，Weiss D，Lassègue B，et al.Superoxide production and expression of Nox family proteins in human atherosclerosis［J］.Circulation，2002，105(12):1429－35.

［12］Lassegue B，Griendling K K.NADPH oxidases:functions and pathologies in the vasculature［J］.Arterioscler Thromb Vasc Biol，2010，30(4):653－61.

［13］Ellmark S H，Dusting G J，F(xiàn)ui M N，et al.The contribution of Nox4 to NADPH oxidase activity in mouse vascular smooth muscle［J］.Cardiovasc Res，2005，65(2):495 －504.

［14］Clempus R E，Sorescu D，Dikalova A E，et al.Nox4 is required for maintenance of the differentiated vascular smooth muscle cell phenotype［J］.Arterioscler Thromb Vasc Biol，2007，27(1):42－8.