劉 卓，隋海娟，閆恩志，劉婉珠，金 英

(遼寧醫(yī)學(xué)院1.藥理學(xué)教研室、2.機能實驗中心，遼寧 錦州 121001)

星形膠質(zhì)細胞(astrocyte，AC)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)體積最大、分布最廣泛的膠質(zhì)細胞，對神經(jīng)元起支持及分隔作用。同時，AC也是免疫活性細胞，能合成分泌多種神經(jīng)遞質(zhì)、激素及神經(jīng)營養(yǎng)因子，維持著神經(jīng)元內(nèi)外環(huán)境、免疫調(diào)節(jié)和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等功能［1］。阿爾采末病 (Alzheimer’s disease，AD)的關(guān)鍵性特征之一是腦內(nèi)炎癥，炎癥過程是由AC和小膠質(zhì)細胞釋放的細胞因子，如TNF-α和IL-1β，并產(chǎn)生其他細胞因子和神經(jīng)毒性物質(zhì)，其中一些炎癥因子反過來誘導(dǎo)更多的膠質(zhì)細胞趨化、活化，另一些則導(dǎo)致局部組織損傷，從而損害神經(jīng)元。

知母為百合科植物知母的干燥根莖，其中知母皂苷(saponins from anemarrhena asphodeloides bge，SAaB)為知母的主要活性成分，在根莖中含約6%，且種類較多，作用廣泛。研究表明SAaB能夠明顯抑制脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)誘導(dǎo)的大鼠小膠質(zhì)細胞的數(shù)目增多以及炎癥因子IL-1β和NO的過度釋放［2］，并且SAaB能對抗淀粉樣β蛋白片段25-35引起小鼠腹腔巨噬細胞炎癥細胞因子TNF-α和NO的分泌［3－4］，提示其有明顯的抗炎作用。本研究采用LPS損傷模型，觀察SAaB對培養(yǎng)的大鼠乳鼠皮質(zhì)AC分泌TNF-α和NO的影響，并進一步探討其調(diào)控c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinases，JNK)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的表達而發(fā)揮抗炎效應(yīng)的可能機制。

1 材料與方法

1.1藥品和試劑SAaB由成都普瑞法科技開發(fā)有限公司提供，批號S08039，HPLC分析純度＞98%，分子質(zhì)量為416.64，臨用時用二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)溶解。DMSO、LPS、DMEM、胰蛋白酶和L-多聚賴氨酸均購自Sigma公司;SP600125購于廈門勵遠有限公司;新生胎牛血清、HEPES、馬血清購于北京華美轉(zhuǎn)導(dǎo)科技有限公司;磷酸化ATF-2抗體(Thr69/71)、磷酸化 JNK1/2抗體(Thr183/Tyr185)和磷酸化c-Jun抗體(Ser63)購于Cell Signaling公司。TNF-α的ELISA試劑盒購于武漢博士德生物科技有限公司;NO檢測Griess試劑盒購于碧云天生物技術(shù)研究所。

1.2大腦皮層AC的培養(yǎng)取出生1～2 d的Sprague-Dawley(SD)大鼠乳鼠，無菌條件下取出大腦皮層，剔除血管和軟腦膜，剪碎后加入0.125%胰蛋白酶37℃消化。待細胞分散后，終止消化。200目篩網(wǎng)過濾、離心，用完全培養(yǎng)基制成細胞懸液，調(diào)整細胞密度為1 ×108～1 ×109cells·L－1，接種在75 cm2培養(yǎng)瓶中，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。以后每3天換液1次，d 9將培養(yǎng)的AC置于水浴恒溫振蕩器上，37℃、260 r·min-1、18 h，舍棄含脫落細胞的細胞懸液，以去除少突膠質(zhì)細胞和小膠質(zhì)細胞，仍貼壁的細胞大部分為AC。用0.25%胰蛋白酶溶液消化后離心，完全培養(yǎng)基重懸，接種于兩個75 cm2培養(yǎng)瓶中以傳代。細胞傳2～3代后進行實驗。

1.3實驗分組及給藥方法取培養(yǎng)第2～3代AC接種于培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)板，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d，待細胞增殖融合成單層，按加入藥物不同分為①對照組:加入0.1%的DMSO;②LPS組:LPS用培養(yǎng)基新鮮配置，終濃度為10 mg·L－1，作用24 h;③ SAaB組:加入不同濃度的 SAaB 1、10、100 μmol·L－1作用1 h后再加入LPS繼續(xù)作用24 h;④ SP600125組:加入 SP600125 10 μmol·L－1作用1 h 后再加入 LPS共同作用24 h或單獨加SP600125作用24 h。

1.4ELISA法測定AC上清液中TNF-α含量AC傳2-3代后進行分組，藥物處理24 h后，收集細胞培養(yǎng)上清液，按TNF-α檢測試劑盒說明書進行操作，在酶標儀上讀取不同濃度TNF-α標準品相應(yīng)的光密度值(A450)，繪制出標準曲線，得出直線回歸方程。測定各組上清液的光密度值，并代入相應(yīng)的直線回歸方程中，計算出TNF-α的含量。

1.5Griess法測定AC培養(yǎng)上清液中NO含量AC傳2～3代后進行分組給藥，收集各組細胞培養(yǎng)上清液，1 500 r·min－1，4℃，離心 10 min，分裝，－80℃凍存。以NO的穩(wěn)定性代謝產(chǎn)物——亞硝酸鹽作為檢測 NO的指標，根據(jù)Griess法測定培養(yǎng)液中NO的含量。

1.6Western blot法檢測磷酸化JNK、磷酸化c-Jun蛋白表達水平細胞經(jīng)實驗因素處理后，離心收集。放入預(yù)冷的裂解緩沖液中，4℃超聲粉碎后，12 000×g離心30 min，取上清，用BCA蛋白定量試劑盒進行蛋白定量。用10%～12%的SDS-PAGE分離蛋白質(zhì)，電泳后將PAGE凝膠中的蛋白質(zhì)電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，取出后將膜放入3%BSA封閉液中，封閉60 min，再用TBST洗膜3次，每次10 min。將膜放入一抗中(1∶500)，4℃孵育過夜。TTBS沖洗后，將膜放入相應(yīng)二抗(1∶1 000)中，室溫孵育1～2 h，漂洗3次。將膜在SuperSignal West Pico底物工作液中孵育5 min，吸干多余試劑，放置化學(xué)發(fā)光凝膠系統(tǒng)分析儀中進行ECL化學(xué)發(fā)光，分析結(jié)果。以每個條帶的Area Density測得值與其相對應(yīng)的總蛋白的比值表示蛋白的表達水平。實驗重復(fù)3次。

1.7免疫熒光染色法檢測AC的ATF-2表達AC經(jīng)藥物處理后，移去培養(yǎng)基，用冷的PBS漂洗2次。4%多聚甲醛室溫固定30 min，PBS漂洗3次，每次10 min。0.3%Triton X-100作用30 min，PBS漂洗3次，每次10 min。3%山羊血清封閉30 min;加入磷酸化ATF-2抗體(1∶100)4℃過夜，PBS漂洗后，加入TRITC標記的二抗作用2 h，PBS漂洗。熒光倒置顯微鏡下觀察，拍照。

1.8統(tǒng)計學(xué)處理實驗結(jié)果數(shù)據(jù)用±s表示，采用one-way ANOVA和LSD’s post hoc test進行統(tǒng)計學(xué)分析。

2 結(jié)果

2.1SAaB對LPS誘導(dǎo)AC分泌TNF-α和NO的影響應(yīng)用ELISA方法和Griess方法分別測定了AC培養(yǎng)液中TNF-α和NO的含量，結(jié)果表明LPS(10 mg·L－1)誘導(dǎo)后AC分泌TNF-α和NO明顯增加，SAaB(1、10 和 100 μmol·L－1)可明顯抑制由LPS誘導(dǎo)AC的TNF-α和NO的分泌。SP600125可對抗LPS誘導(dǎo)AC分泌TNF-α和NO增加，說明LPS誘導(dǎo)的TNF-α和NO產(chǎn)生增加與激活JNK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路有關(guān)，單獨應(yīng)用SP600125對AC正常分泌TNF-α和NO無明顯作用(Tab 1)。

Tab 1 Effects of SAaB and SP600125 on LPS-induced release of TNF-α and NO in cultured medium of astrocytes(±s，n=6)

Tab 1 Effects of SAaB and SP600125 on LPS-induced release of TNF-α and NO in cultured medium of astrocytes(±s，n=6)

＊＊P＜0.01 vs control group;#P＜0.05，##P＜0.01 vs LPS group

Group TNF-α/ng·L －1NO/μmol·L －1 Control 1.95 ±0.26 5.78 ±0.94 LPS 11.89 ±1.51＊＊ 16.44 ±1.79＊＊LPS+SAaB 1 μmol·L －1 9.86 ±1.12## 13.26 ±1.97#LPS+SAaB 10 μmol·L－1 5.99 ±1.39## 8.73 ±1.49##LPS+SAaB 100 μmol·L－1 3.45 ±0.68## 6.51 ±0.86##LPS+SP600125 10 μmol·L －1 4.23 ±0.41## 7.47 ±0.90##SP600125 10 μmol·L －12.15 ±0.32 5.37 ±0.68

2.2SAaB對AC磷酸化JNK和磷酸化c-Jun蛋白表達水平的影響Fig 1，2顯示，LPS作用后，AC磷酸化JNK、c-Jun蛋白表達水平明顯增加，SAaB(1、10 和100 μmol·L－1)可明顯對抗 LPS 誘導(dǎo) AC的磷酸化JNK和磷酸化c-Jun蛋白水平增加;但總量JNK(Total-JNK，T-JNK)和總量 c-Jun(Total-c-Jun，T-c-Jun)蛋白表達幾乎沒有改變。

2.3免疫熒光觀察SAaB對LPS引起AC的磷酸化ATF-2表達水平的影響正常對照組AC內(nèi)幾乎沒有染色，說明正常情況下AC的磷酸化ATF-2蛋白表達水平極低(Fig 3A);LPS刺激后熒光染色強度明顯增加，說明AC的磷酸化ATF-2表達水平明顯增加(Fig 3B)，SAaB(10 和100 μmol·L－1)能明顯抑制LPS的作用，使磷酸化ATF-2表達水平明顯降低(Fig 3C、3D)，SP600125(10 μmol·L-1)也可明顯減少LPS引起AC的磷酸化ATF-2蛋白表達上調(diào)(Fig 3E)。

Fig 1 Effects of SAaB on LPS-induced phospho-JNK level in astrocytes in rats by Western blot

Fig 2 Effect of SAaB on the expression of phospho-c-Jun level in cultured astrocytes in rats by Western blot

3 討論

Fig3 EffectofSAaB and SP600125 on activating transcription Factor-2(ATF-2)n cultured astrocytes in rats by immunostaining(×400)

在AD患者的腦內(nèi)發(fā)現(xiàn)有明顯的膠質(zhì)細胞反應(yīng)，老年斑周圍有大量活化的AC包裹［5］。研究表明，在病理條件下AC從靜息狀態(tài)快速轉(zhuǎn)化成活化狀態(tài)，并且其活化具有瀑布效應(yīng)，活化的AC可分泌大量的細胞炎癥介質(zhì)如IL-1β、IL-6及TNF-α等，這些物質(zhì)對神經(jīng)元有毒性作用，使神經(jīng)元凋亡并壞死［6－7］。革蘭陰性菌細胞壁的主要成分LPS可以刺激靶細胞直接分泌炎癥因子，更重要的是可以通過信號轉(zhuǎn)導(dǎo)作用，將胞外刺激轉(zhuǎn)入細胞核內(nèi)，進一步擴大和增強各種炎癥因子的作用?，F(xiàn)已證實JNK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑參與了炎癥反應(yīng)中星形膠質(zhì)細胞活化的過程［8－9］，并在細胞炎癥反應(yīng)的病理過程中起著至關(guān)重要的作用。JNK又稱SAPK，即應(yīng)激活化蛋白激酶，是絲裂原活化的蛋白激酶家族之一，主要受炎性細胞因子和應(yīng)激信號的激活引起應(yīng)激反應(yīng)，從而導(dǎo)致細胞生長停滯和凋亡。JNK一旦被激活，其雙磷酸化功能區(qū)Thr-Pro-Tyr與c-Jun N端的活化區(qū)結(jié)合并使其第63、73位絲氨酸殘基磷酸化從而使其活化并轉(zhuǎn)移到細胞核，激活其下游c-Jun，引起級聯(lián)反應(yīng)［10－11］。c-Jun是細胞內(nèi)的一個重要轉(zhuǎn)錄因子，細胞遭受凋亡刺激時c-Jun被上游激酶磷酸化激活，上調(diào)自身表達同時，活化的c-Jun必須與ATF-2［12］或c-Fos［13］形成復(fù)合物才能發(fā)揮轉(zhuǎn)錄活性。本實驗結(jié)果中特異性JNK特異性阻斷劑SP600125可對抗LPS誘導(dǎo)AC分泌炎癥因子TNF-α和NO增加，并且LPS可引起磷酸化JNK、c-Jun以及ATF-2的蛋白表達水平增高，都說明LPS誘導(dǎo)炎癥因子分泌的增加與激活JNK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路有關(guān)。

本研究通過LPS造成AC炎癥模型，觀察到SAaB能夠明顯減少LPS引起的炎癥因子TNF-α和NO分泌增多，同時能下調(diào)LPS引起的磷酸化JNK、c-Jun和ATF-2蛋白表達水平，表明了SAaB對星形膠質(zhì)細胞炎癥反應(yīng)有明顯的抑制作用，并且該作用與其下調(diào)了JNK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路有關(guān)。已證實SAaB可通過上調(diào)腦膽堿能受體［14］、清除自由基、抑制小膠質(zhì)細胞炎癥、抗海馬神經(jīng)細胞凋亡以及增加海馬突觸相關(guān)蛋白的表達［15］等方面明顯改善AD模型的學(xué)習(xí)記憶障礙，本實驗通過SAaB抑制AC的炎癥作用，為其治療AD又提供了一條新途徑。

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