朱成琳，張丹參，宋金艷，宋志斌，薛貴平

(河北北方學(xué)院藥理學(xué)教研室，河北張家口 075000)

大黃酚(chrysophanol，Chry)為中藥大黃的有效成分之一，近期研究表明，大黃酚具有明顯的抗衰老作用［1］，并且還有抗大鼠肝、腦過(guò)氧化脂質(zhì)生成的作用［2－3］。近期有研究者結(jié)合現(xiàn)代藥劑新技術(shù)，制備出大黃酚納米囊、微囊、包合物和脂質(zhì)體等多種制劑，其中大黃酚脂質(zhì)體的脂溶性較好，有腦部靶向性，對(duì)神經(jīng)性損傷療效最佳［4］。阿爾采末病(AD)是一種比較常見的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，記憶減退和認(rèn)知功能障礙是其主要的臨床特征，大黃酚脂質(zhì)體能否改善AD患者的學(xué)習(xí)記憶障礙，尚未見報(bào)道。本研究采用1次性直接側(cè)腦室注射(icv)凝聚態(tài)β-淀粉樣肽(Aβ25-35)的方法建立 AD 小鼠模型［5］，選擇大黃酚脂質(zhì)體制劑對(duì)AD模型小鼠學(xué)習(xí)記憶的影響進(jìn)行觀察并探討可能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物♂昆明種小鼠，體質(zhì)量25～28 g，由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所提供(許可證編號(hào):SCXK京2004-0001)。

1.2儀器LabTech UV9100全自動(dòng)紫外可見分光光度計(jì)(LabTech公司);SIGMA 3K30高速冷凍離心機(jī)(德國(guó));Forma－86℃超低溫冰箱(Thermo elecerom);ME235P型電子分析天平(北京賽多利斯儀器有限公司);FSH-2型可調(diào)高速勻漿器(江蘇大地自動(dòng)化儀器廠);微量進(jìn)樣器(寧波市鎮(zhèn)海玻璃儀器廠);STT-2跳臺(tái)儀(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所);Y型水迷宮(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所);HH-1型數(shù)顯恒溫水浴鍋(江蘇金壇精達(dá)儀器廠);SZ-97自動(dòng)三重純水蒸餾器(上海亞榮生化儀器廠)。

1.3藥品與試劑大黃酚標(biāo)準(zhǔn)品(中國(guó)生物制品檢定所提供，批號(hào)110796-201017);大黃酚對(duì)照品(質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%，陜西寶雞國(guó)康生物藥品有限公司，批號(hào) GKSW20100814);β-淀粉樣肽(β-amyloid peptide， Aβ25-35)(美 國(guó) Sigma 公 司，批 號(hào)108K4794);N，N-二甲基甲酰胺、吐溫-80、膽固醇、卵磷脂、鄰苯三酚、鉬酸銨、聚乙二醇2000、維生素E、無(wú)水乙醇等試劑均為分析純;實(shí)驗(yàn)用水為三重蒸餾水。

1.4藥品的制備制備大黃酚N，N-二甲基甲酰胺單體［大黃酚對(duì)照品用生理鹽水:N，N-二甲基甲酰胺(DMF)∶吐溫-80=8∶1∶1溶解］溶液［3］，薄膜蒸發(fā)法制備大黃酚脂質(zhì)體［6］溶液，將這兩種劑型均稀釋成1 ×10－3mg·L－1備用。

1.5分組及給藥取健康♂昆明種小鼠70只，體質(zhì)量25 g～28 g，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，按體質(zhì)量均衡原則隨機(jī)分為7組(n=10)，即正常對(duì)照組、Aβ25-35致AD模型組、大黃酚脂質(zhì)體溶劑對(duì)照組、大黃酚單體組(10 mg·kg-1)、大黃酚脂質(zhì)體高、中、低劑量組(10、1、0.1 mg·kg－1)［4］。

1.6建立Aβ25-35致AD模型方法Aβ25-35，用滅菌蒸餾水溶解，濃度1.0 mmol·L－1，密封后置37℃培養(yǎng)箱中孵育72 h，使其成凝聚狀態(tài)，－20℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩⑿∈笥?.5%水合氯醛(10 mg·kg－1)腹腔注射麻醉后，用手抓住小鼠頭部皮膚并將皮膚拉緊，在距頭部中線2 mm處與兩側(cè)耳根前部連線相交叉的點(diǎn)，用10 μl微量進(jìn)樣器垂直刺入3.0 mm，穿破顱骨，進(jìn)入腦室，模型組、溶劑組、單體組、脂質(zhì)體組緩慢注入Aβ25-35溶液3 μl，正常對(duì)照組緩慢注入3 μl生理鹽水，并停留 5 min［5］。

1.7給藥方法AD模型建立后，正常對(duì)照組和模型組立即尾靜脈注射生理鹽水，其余各組給予相應(yīng)的溶劑和藥物，10 mg·kg－1，每天1次，連續(xù)給藥8 d。

1.8Y型水迷宮對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)習(xí)記憶功能的測(cè)試d 3采用Y型水迷宮實(shí)驗(yàn)監(jiān)測(cè)小鼠學(xué)習(xí)記憶功能。記錄小鼠平均逃避潛伏期(從入水起點(diǎn)至尋找到階梯出水的時(shí)間)和正確反應(yīng)次數(shù)(以10 s內(nèi)直接抵達(dá)平臺(tái)為正確反應(yīng))［7］。預(yù)訓(xùn)練1 d，每天10次，每次訓(xùn)練時(shí)間定為3 min，3 min仍未找到安全通道者以180 s計(jì)算。正式測(cè)試2 d，每天10次，每次測(cè)試時(shí)間定為3 min，3 min仍未找到安全通道者以180 s計(jì)算。

1.9采用跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)習(xí)記憶功能的測(cè)試給藥后6 d采用跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)訓(xùn)練小鼠學(xué)習(xí)記憶功能。跳臺(tái)裝置為一被動(dòng)回避反射箱，箱底鋪以銅柵作為刺激電極，箱內(nèi)均分為5個(gè)小格，右后角放置一個(gè)的橡膠質(zhì)平臺(tái)作為回避電擊安全區(qū)。實(shí)驗(yàn)時(shí)將5只小鼠分別放入反射箱的5個(gè)小格內(nèi)適應(yīng)3 min，然后通入36 V交流電，小鼠受電擊，正常反應(yīng)是跳回平臺(tái)以躲避傷害性刺激。多數(shù)小鼠可能再次或多次跳至銅柵上，受到電擊后又迅速跳回平臺(tái)。以小鼠兩前足同時(shí)接觸銅柵遭到電擊為錯(cuò)誤反應(yīng)，觀察并記錄5 min內(nèi)錯(cuò)誤反應(yīng)次數(shù)［8］。24 h后測(cè)驗(yàn)，以觀察其記憶保持情況，測(cè)試時(shí)記錄小鼠在第1次跳下平臺(tái)的潛伏期及5 min內(nèi)的錯(cuò)誤反應(yīng)次數(shù)。以7 d和8 d的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)為正式測(cè)試數(shù)據(jù)。

1.10小鼠耐缺氧實(shí)驗(yàn)方法學(xué)習(xí)記憶實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，將小鼠禁食12 h，自由飲水，用大剪刀于小鼠耳根后部快速斷頭，同時(shí)紀(jì)錄小鼠張口次數(shù)和張口呼吸時(shí)間，測(cè)定小鼠斷頭耐缺氧生存時(shí)間，以5 s不再?gòu)埧诤粑鼮橛^察指標(biāo)不再計(jì)時(shí)［1］。

1.11比色法測(cè)定小鼠腦組織SOD、CAT酶活性學(xué)習(xí)記憶實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，將小鼠禁食12 h，自由飲水，用大剪刀于小鼠耳根后部快速斷頭處死，迅速于冰盒上取其全腦(去小腦)，4℃生理鹽水沖洗，濾紙吸干水分，精密稱重，用4℃滅菌生理鹽水制成10%腦勻漿，3 000 r·min離心15 min，取上清液，采用鄰苯三酚自氧化法測(cè)定小鼠腦組織中SOD活性［9］，鉬酸銨顯色法測(cè)CAT活性［10］。

1.12數(shù)據(jù)處理數(shù)據(jù)資料采用Excel軟件分析，用±s表示，并用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件，運(yùn)用t檢驗(yàn)進(jìn)行比較。

2 結(jié)果

2.1大黃酚脂質(zhì)體對(duì)Aβ25-35致AD模型小鼠Y迷宮實(shí)驗(yàn)的影響結(jié)果表明:Aβ25-35模型組與空白對(duì)照組比較，模型組小鼠的逃避潛伏期明顯延長(zhǎng)(P＜0.01)，正確反應(yīng)次數(shù)明顯減少(P＜0.01);大黃酚脂質(zhì)體高、中劑量組和單體組與溶劑對(duì)照組相比，潛伏期明顯縮短(P＜0.05～P＜0.01)，正確反應(yīng)次數(shù)明顯增加(P＜0.05～P＜0.01)，大黃酚脂質(zhì)體低劑量組對(duì)上述各項(xiàng)指標(biāo)無(wú)改善作用(P＞0.05)，說(shuō)明大黃酚脂質(zhì)體的上述藥理作用有劑量依賴性;大黃酚脂質(zhì)體高劑量組與等濃度的大黃酚單體組也有明顯差異(P＜0.05)。說(shuō)明大黃酚脂質(zhì)體上述藥理作用要優(yōu)于大黃酚單體溶液。見Tab 1。

2.2大黃酚脂質(zhì)體對(duì)Aβ25-35致AD模型小鼠跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)的影響結(jié)果表明:Aβ25-35模型組與空白對(duì)照組比較，模型組小鼠的潛伏期明顯縮短(P＜0.01)，錯(cuò)誤反應(yīng)次數(shù)明顯增加(P＜0.01);大黃酚脂質(zhì)體高、中劑量組、大黃酚單體組與溶劑對(duì)照組相比，潛伏期明顯延長(zhǎng)(P＜0.05～P＜0.01)，錯(cuò)誤反應(yīng)次數(shù)明顯減少(P＜0.05～P＜0.01)，大黃酚脂質(zhì)體低劑量組對(duì)上述各項(xiàng)指標(biāo)無(wú)改善作用(P＞0.05)，說(shuō)明大黃酚脂質(zhì)體的上述藥理作用有劑量依賴性;大黃酚脂質(zhì)體高劑量組與等濃度的大黃酚單體組也有明顯差異(P＜0.05～P＜0.01)，說(shuō)明大黃酚脂質(zhì)體上述藥理作用要優(yōu)于大黃酚單體溶液。見Tab 1。

2.3大黃酚脂質(zhì)體對(duì)Aβ25-35致AD模型小鼠斷頭耐缺氧生存時(shí)間的影響結(jié)果表明:Aβ25-35模型組與空白對(duì)照組比較，模型組小鼠斷頭耐缺氧生存時(shí)間和張口呼吸次數(shù)均明顯縮短(P＜0.01);大黃酚脂質(zhì)體高、中劑量組、大黃酚單體組與溶劑對(duì)照組相比，小鼠斷頭耐缺氧生存時(shí)間和張口呼吸次數(shù)均明顯增加(P＜0.05～P＜0.01)，大黃酚低劑量組對(duì)上述各項(xiàng)指標(biāo)無(wú)改善作用(P＞0.05)，說(shuō)明大黃酚脂質(zhì)體的上述藥理作用有劑量依賴性;大黃酚脂質(zhì)體高劑量組與等濃度的大黃酚單體組也有明顯差異(P＜0.05)，說(shuō)明大黃酚脂質(zhì)體上述藥理作用要優(yōu)于大黃酚單體溶液。見Tab 2。

Tab 1 Effects of chrysophanol liposomes on AD model mice in Y-maze and step-down test(±s，n=10)

Tab 1 Effects of chrysophanol liposomes on AD model mice in Y-maze and step-down test(±s，n=10)

△△P＜0.01 vs control;#P＜0.05，##P＜0.01 vs liposomes solvent;*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs chry

Group Dose/mg·kg－1 Y-maze test Step-down test Latent period/s No.of cor.Latent period/s No.of err.Control 4.30 ±1.76 6.7 ±2.3 210 ±43 0.7 ±0.5 Model 8.76 ±1.32△△ 3.4 ±1.7△△ 94 ±29△△ 2.9 ±0.9△△Liposomes solvent 8.21 ±1.54 4.1 ±1.1 101 ±26 2.5 ±1.1 Chry 10 5.27 ±2.12## 5.6 ±2.0## 143 ±51## 1.4 ±1.0##Chry liposomes 10 4.96 ±1.29##* 5.9 ±1.1##* 162 ±36##＊＊ 1.2 ±0.7##*Chry liposomes 1 6.69 ±1.44# 5.5 ±1.3# 121 ±22# 1.9 ±0.5#Chry liposomes 0.1 7.62 ±1.65 4.8 ±1.6 98 ±17 2.5 ±0.6

Tab 2 Effects of chrysophanol liposomes on AD mice SOD and CAT activities in brain and breakage anoxia tolerance test(±s，n=10)

Tab 2 Effects of chrysophanol liposomes on AD mice SOD and CAT activities in brain and breakage anoxia tolerance test(±s，n=10)

△P＜0.05，△△P＜0.01 vs control;#P＜0.05，##P＜0.01 vs liposomes solvent;*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs chry

Group Dose/mg·kg－1 No.mouth Survival time/s SOD/kU·g－1 CAT/kU·g －1 Control 11.2 ±3.1 14.39 ±4.10 693 ±12.6 14.8 ±3.6 Model 6.6 ±2.9△△ 7.78 ±3.12△△ 408 ±42.2△△ 7.3 ±3.2△△Liposomes solvent 7.4 ±1.9 9.89 ±2.38 416 ±26.7 8.7 ±2.0 Chry 10 9.5 ±3.2## 13.05 ±2.25## 551 ±44.9## 13.1 ±2.8##Chry liposomes 10 10.2 ±2.1##* 13.60 ±2.92##* 569 ±31.6##＊＊ 13.9 ±1.5##*Chry liposomes 1 8.9 ±2.7# 11.04 ±2.67# 470 ±27.6# 11.6 ±2.1#Chry liposomes 0.1 7.2 ±1.4 10.66 ±2.54 424 ±18.4 10.2 ±2.6

2.4大黃酚脂質(zhì)體對(duì)Aβ25-35致AD模型小鼠腦組織中SOD與CAT酶活性的影響結(jié)果表明:Aβ25-35模型組與空白對(duì)照組比較，模型組小鼠腦組織中SOD與CAT酶活性均明顯降低(P＜0.01);大黃酚脂質(zhì)體高、中劑量組、大黃酚單體組與溶劑對(duì)照組相比，小鼠腦組織中SOD與CAT活性均明顯升高(P＜0.05～P＜0.01)，大黃酚低劑量組對(duì)上述各項(xiàng)指標(biāo)無(wú)明顯改善作用(P＞0.05)，說(shuō)明大黃酚脂質(zhì)體的上述藥理作用有劑量依賴性;大黃酚脂質(zhì)體高劑量組與等濃度的大黃酚單體組差異有顯著性(P＜0.05～P＜0.01)，說(shuō)明大黃酚脂質(zhì)體上述藥理作用要優(yōu)于大黃酚單體溶液。見Tab 2。

3 討論

阿爾采末病是一種進(jìn)行性中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行綜合征，主要表現(xiàn)為記憶、認(rèn)知、語(yǔ)言和行為障礙及人格改變等，其中以學(xué)習(xí)記憶下降為主要癥狀，嚴(yán)重影響中老年人的生活質(zhì)量［11］，隨著全球人口老齡化趨勢(shì)日益明顯，AD作為老年性癡呆中最常見的一種類型，已成為一個(gè)重要的社會(huì)問(wèn)題，因此積極探討癡呆性疾病的藥物治療和預(yù)防具有重大醫(yī)學(xué)價(jià)值和社會(huì)意義。以往研究表明，大黃酚單體具有明顯的抗神經(jīng)性損傷作用，而本實(shí)驗(yàn)選擇大黃酚脂質(zhì)體制劑，采用尾靜脈注射方式，發(fā)現(xiàn)脂質(zhì)體制劑比單體溶液有更好的改善AD模型小鼠學(xué)習(xí)記憶的能力，并能提高腦組織中SOD與CAT的活性，提示大黃酚改善Aβ25-35致AD模型小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的機(jī)制，可能是通過(guò)提高抗氧化酶活性，減少氧化應(yīng)激介導(dǎo)的Aβ25-35的神經(jīng)毒性，同時(shí)防止自由基組織對(duì)細(xì)胞的氧化損傷，保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞免受過(guò)氧化脂質(zhì)的破壞，改善細(xì)胞功能和能量代謝障礙而實(shí)現(xiàn)的。本實(shí)驗(yàn)給藥方式采用尾靜脈注射方式，相比以往的腹腔注射、口服灌注等其他給藥方式，能減少吸收過(guò)程帶來(lái)的藥物損失，而且靜脈給藥方式作用迅速，為大黃酚早日進(jìn)入臨床實(shí)驗(yàn)提供必要的實(shí)驗(yàn)支持。本實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)小劑量的大黃酚脂質(zhì)體對(duì)改善小鼠學(xué)習(xí)記憶和酶活性的影響不明顯(Chry 0.1 mg·kg－1，P＞0.05)，提示大黃酚脂質(zhì)體的作用有劑量依賴性。

大黃酚脂質(zhì)體具有明顯的抗缺氧和提高小鼠耐力、抗疲勞的能力，可能與其擴(kuò)血管作用有關(guān)［12］，本實(shí)驗(yàn)表明，AD模型小鼠斷頭耐缺氧生存時(shí)間縮短、張口次數(shù)減少，而大黃酚脂質(zhì)體制劑能明顯提高斷頭耐缺氧時(shí)間和張口次數(shù)，缺氧對(duì)機(jī)體是一種劣性刺激，尤其影響機(jī)體的供能。大黃酚脂質(zhì)體在腦缺氧過(guò)程中也起到了保護(hù)作用，說(shuō)明大黃酚制劑在Aβ?lián)p傷神經(jīng)細(xì)胞的過(guò)程中起到了保護(hù)作用。

大黃酚難溶于水，口服吸收差且有腸胃刺激，將其制成脂質(zhì)體制劑后，提高了藥物的穩(wěn)定性、安全性、有效性和靶向性［13］，對(duì)AD模型小鼠記憶功能障礙、老化相關(guān)酶和耐缺氧方面有明顯的保護(hù)作用，因此，大黃酚脂質(zhì)體制劑有可能成為治療AD的新型藥物。

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