鐮刀菌(Fusarium sp. B158)色素的提取及其理化性質(zhì)

曾祥龍，蔡宇杰,*，廖祥儒，曾祥康，李枝玲，張大兵

(1.江南大學 工業(yè)生物技術教育部重點實驗室，江蘇 無錫 214122；2.江蘇漢邦科技有限公司，江蘇 淮安 223001)

鐮刀菌(Fusarium sp. B158)色素的提取及其理化性質(zhì)

曾祥龍1，蔡宇杰1,*，廖祥儒1，曾祥康1，李枝玲2，張大兵2

(1.江南大學 工業(yè)生物技術教育部重點實驗室，江蘇 無錫 214122；2.江蘇漢邦科技有限公司，江蘇 淮安 223001)

從一株新型鐮刀菌(Fusarium sp. B158)液態(tài)發(fā)酵菌絲體提取色素，并對其理化性質(zhì)進行研究。結(jié)果表明：該色素的最佳提取溶劑是酸性乙醇(pH2)。色素的全波長掃描顯示，該色素在324nm和360nm波長處均有吸收峰，實驗，選擇360nm作為色素的最大檢測波長。色素的穩(wěn)定性研究表明，色素對熱、光、甜味劑以及常見食品添加劑表現(xiàn)穩(wěn)定，對溶劑的pH值以及氧化劑和還原劑敏感。大部分的金屬離子(Cu2+和Fe3+除外)對色素的穩(wěn)定性影響不大。

色素；提??；穩(wěn)定性；鐮刀菌

色素，又稱著色劑，作為食品添加劑被廣泛應用在食品行業(yè)中，是決定食品質(zhì)量的關鍵因素之一，此外在印染、化妝品和醫(yī)藥行業(yè)也有所應用。按照其來源，可以分為人工合成色素和天然色素[1]。長期以來，人工合成色素因其毒副作用，而使用受限[2]，不少人工合成色素相繼從各國許可使用的名單中刪除。天然色素因其安全無毒，色澤自然同時兼具營養(yǎng)價值和藥理功能等優(yōu)越性而日益受到關注和青睞。隨著人們消費觀念的改變和對自身健康關注的增加，對于天然色素的研究和開發(fā)投入增長迅速[2]。

產(chǎn)天然色素的微生物種類繁多，目前已經(jīng)報道的有原核生物、細菌、真菌、酵母和藻類等，色素顏色包括紅、黃、藍、綠、黑、棕、紫等。產(chǎn)天然色素的微生物開發(fā)過程[3-5]主要包括以下幾個部分：產(chǎn)天然色素微生物的篩選和鑒定[6]；天然色素的提取和分離純化鑒定[7-8]；天然色素的理化性質(zhì)和應用開發(fā)研究[9-13]；天然色素的微生物發(fā)酵生產(chǎn)[14-17]。

鐮刀菌作為一類在自然界中廣泛存在和分布的真菌微生物，對其產(chǎn)天然色素的報道早已有之，具有良好的天然色素生產(chǎn)潛力，但對其早期的研究主要集中在致病機理上[18-19]。近年來，隨著人們對于天然色素需求的增加，對鐮刀菌產(chǎn)天然色素的開發(fā)利用逐漸增加[20]?；趯︾牭毒l(fā)酵產(chǎn)天然色素應用前景的看好，本實驗從一株產(chǎn)天然色素的鐮刀菌(Fusarium sp. B158)液態(tài)發(fā)酵菌絲體中提取色素粗品，并對其理化性質(zhì)進行研究，以探究該色素在工業(yè)生產(chǎn)中的應用前景和價值。

1 材料與方法

1.1 菌種與培養(yǎng)基

鐮刀菌(Fusarium sp. B158)，本實驗室篩選并保藏。

PDA培養(yǎng)基(g/L)：土豆200、葡萄糖20、瓊脂20，pH值自然；種子培養(yǎng)基(g/L)：土豆200、葡萄糖20，pH值自然；液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：土豆200、葡萄糖20、酵母膏2.5、KH2PO40.005，pH值自然。

1.2 試劑與儀器

甲醇、正丙醇、異丙醇、正丁醇、正己烷、丙酮、氯仿、無水乙醇、乙酸、乙酸乙酯、石油醚、二甲基亞砜、葡萄糖、蔗糖、檸檬酸、苯甲酸鈉、山梨酸鉀、亞硫酸鈉、雙氧水等均為分析純。

CR22GⅡ高速冷凍離心機 日本Hitachi公司；YXQLS-50SII立式壓力蒸汽滅菌鍋 西安常儀生化儀器有限公司；UV-3000紫外-可見分光光度計 深圳市凱銘杰儀器有限公司；PB-10 pH計 賽多利斯科學儀器有限公司；EZ585Q冷凍干燥機 美國FTS公司；SW-CJ-1F超凈工作臺 河南天馳儀器設備有限公司；HZC-250回轉(zhuǎn)式恒溫搖床 常州諾基儀器有公司；5BG-7000氣升式發(fā)酵罐 上海保興生物設備工程有限公司。

1.3 方法

1.3.1 鐮刀菌的培養(yǎng)及色素提取

從斜面上挑取一小塊菌落轉(zhuǎn)接到種子培養(yǎng)基中(250mL三角瓶，裝液量50mL)，于26℃、200r/min旋轉(zhuǎn)式搖床中培養(yǎng)36h后，接到4L發(fā)酵罐中(裝液量3.5L，接種量5%)，發(fā)酵72h。發(fā)酵液經(jīng)10000×g離心10min，收集紅色菌體冷凍干燥，加入4倍體積的酸性乙醇(pH2)浸提4h，10000×g離心10min得黃色色素提取液，向提取液中加入1mol/L NaOH溶液到色素溶液顏色褪盡出現(xiàn)暗紅色沉淀為止，10000×g離心10min得暗紅色沉淀，即為色素粗品。

1.3.2 提取溶劑對色素提取的影響

分別加入10mL的水、無水乙醇、酸性乙醇(pH2)、甲醇、正丙醇、異丙醇、正丁醇、正己烷、丙酮、氯仿、乙酸、乙酸乙酯、石油醚、二甲基亞砜溶液到干質(zhì)量為0.1g的菌絲體中，室溫條件下浸提4h。

1.3.3 物理和化學處理對色素顏色的影響

對色素溶液進行物理和化學(光照、化學試劑、緩沖液)處理，觀察色素溶液顏色變化。取10mL色素酸性乙醇溶液分別放置在日光燈與紫外燈下照射1h。在10mL色素酸性乙醇溶液中分別加入200μL質(zhì)量濃度為1g/100mL的中性醋酸鉛、三氯化鐵、碳酸鈉溶液及氨水、濃硫酸和濃鹽酸，反應5min后觀察色素溶液變化情況。

1.3.4 色素的穩(wěn)定性研究

1.3.4.1 溫度對色素穩(wěn)定性的影響

取5mL色素酸性乙醇溶液分別置于4、20、30、40、50、60、70、80、90、100℃的水浴鍋中加熱1h，迅速冷卻至室溫，測吸光度。

1.3.4.2 光照對色素穩(wěn)定性的影響

取10mL色素酸性乙醇溶液倒于平皿中(用保鮮膜封口)，分別置于黑暗、太陽光和紫外燈下24h，每隔3h測1次吸光度。

1.3.4.3pH值對色素穩(wěn)定性的影響

在1mL色素酸性乙醇溶液中加入pH1～12緩沖液，靜置1h，觀察色素溶液顏色的變化。

1.3.4.4 金屬離子對色素穩(wěn)定性的影響

在5mL色素酸性乙醇溶液中分別加入500μL濃度為0.005、0.05、0.1mol/L的各種金屬離子(Mg2+、Ca2+、Cu2+、Fe3+、Na+、K+、Al3+、Zn2+)溶液。振蕩搖勻后黑暗中靜置24h，測吸光度。

1.3.4.5 氧化劑與還原劑對色素穩(wěn)定性的影響

分別取1mL質(zhì)量濃度為0、0.2、0.4、0.6、0.8g/100mL的Na2SO3溶液和H2O2溶液加入到5mL色素酸性乙醇溶液中，振蕩搖勻后靜置4h，測吸光度。

1.3.4.6 葡萄糖和蔗糖對色素穩(wěn)定性的影響

分別取1mL質(zhì)量濃度為0、2.5、5、7.5、10g/100mL的葡萄糖和蔗糖溶液加入到5mL色素酸性乙醇溶液中，振蕩搖勻后靜置4h，測吸光度。

1.3.4.7 食品添加劑對色素穩(wěn)定性的影響

取200μL質(zhì)量濃度為 1g/100mL的苯甲酸鈉、檸檬酸和山梨酸鉀溶液加入到5mL色素酸性乙醇溶液中，振蕩搖勻后在暗處靜置24h，定時測吸光度。

2 結(jié)果與分析

2.1 測定色素含量最佳波長的確定

取10mg色素粗品溶于4mL的酸性乙醇(pH2)，以酸性乙醇(pH2)溶液作為空白，在200～700nm波長范圍內(nèi)掃描，結(jié)果見圖1。在200～700nm波長范圍內(nèi)，該色素在324nm和360nm波長處均有吸收峰，考慮到提取液中可能存在的核酸和蛋白質(zhì)類物質(zhì)在紫外區(qū)均有吸收，而該色素在可見光區(qū)基本沒有吸收峰出現(xiàn)，因而選取更靠近可見光區(qū)的360nm作為最大檢測波長用于測定色素溶液的吸光度，以提高色素含量測定的靈敏度和穩(wěn)定性。

圖1 色素吸收光譜圖Fig.1 Absorption spectrum of the pigments

2.2 提取溶劑對色素提取的影響

表1 色素在不同溶劑中的溶解情況Table 1 Solubility of the pigments in different solvents

在選擇用溶劑萃取法提取天然色素時，應當考慮色素來源和性質(zhì)的不同。較常使用的溶劑是乙醇、水、丙酮、氯仿、石油醚等。由表1可知，F(xiàn)usarium sp. B158所產(chǎn)色素易溶于酸性乙醇和乙酸乙酯，微溶于二甲基亞砜。在酸性條件中顯黃色，二甲基亞砜中顯紅色。從安全與經(jīng)濟上來考慮，選用酸性乙醇(pH2)作為最佳提取溶劑。

2.3 物理和化學處理對色素顏色的影響

表2 物理和化學處理對色素顏色的影響Table 2 Effect of physical and chemical treatments on the color of the pigments

由表2可知，該色素經(jīng)不同的物理和化學處理后，其顏色會發(fā)生變化。在可見光和紫外線下，色素顏色不會發(fā)生變化，而氨水和碳酸鈉因能改變?nèi)芤旱膒H值而造成色素顏色發(fā)生變化，并且有沉淀生成。中性醋酸鉛能使色素形成白色沉淀，可能是因為該色素中含有能與中性醋酸鉛反應形成絡合物的鄰二酚羥基或其他基團。氯化鐵會使色素生成綠色沉淀，說明色素中含有游離酚羥基[21]。經(jīng)過濃鹽酸和濃硫酸處理后，色素顏色并未發(fā)生變化，是因為色素在酸性條件下能穩(wěn)定存在。

2.4 色素的穩(wěn)定性

天然色素本身存在著很多缺陷，其中主要為穩(wěn)定性差。在提取和應用的過程中，熱、光、空氣、金屬離子、pH值和其他成分的存在會導致色素的變質(zhì)或變色。因而，在天然色素的研究中，對其穩(wěn)定性進行研究是很有必要的。

2.4.1 溫度對色素穩(wěn)定性的影響

圖2 溫度對色素穩(wěn)定性的影響Fig.2 Effect of temperature on the stability of the pigments

由圖2可知，在60℃以下加熱色素時，吸光度變化不大；在60℃以上加熱時，吸光度明顯降低。說明該色素具有一定的熱穩(wěn)定性，當溫度超過60℃時，其對溫度變化變得較為敏感。這可能是因為色素在加熱時，不僅會氧化分解，有時還能夠引起分解或聚合反應，特別是當色素中的其他雜質(zhì)較多時，如膠質(zhì)過多時，加熱會引起色素與其聚合成不溶物[22]。

2.4.2 光照對色素穩(wěn)定性的影響如圖3所示，在室內(nèi)避光放置24h，該色素不會變化，在太陽光直射和紫外燈下照射24h后，色素有些褪色，但不明顯；吸光度有所下降，但變化不大。說明該色素具有較好的光穩(wěn)定性。但仍應盡量避免在加工和使用過程中長時間的日光和紫外線直射。

圖3 光照對色素穩(wěn)定性的影響Fig.3 Effect of light on the stability of the pigments

2.4.3pH值對色素穩(wěn)定性的影響

表3 pH值對色素穩(wěn)定性的影響Table 3 Effect of pH on the stability of the pigments

由表3可知，色素的顏色特征會隨著緩沖液pH值的不同而發(fā)生變化，這與前期實驗相符合，即該色素在酸性條件下能夠穩(wěn)定存在并且顯黃色，在中性和堿性條件下，色素的顏色和穩(wěn)定性都會受到影響。

2.4.4 金屬離子對色素穩(wěn)定性的影響

表4 金屬離子對色素穩(wěn)定性的影響Table 4 Effect of metal ions on the stability of the pigments

由表4可知，Ca2+、Al3+、K+、Na+、Zn2+、Mg2+對色素的穩(wěn)定性影響不大，靜置24h后色素的吸光度變化不大。Cu2+的存在使得色素的吸光度增加，同時色素顏色變?yōu)樗{色，這是由于Cu2+溶液本身的顏色是藍色，覆蓋和遮掩了色素溶液原有的黃色，從而引起其吸光度和顏色的變化。Fe3+本身有很深的黃色，因而可以增加色素溶液的吸光度，綠色沉淀的產(chǎn)生可能是由于色素的某些基團能夠與Fe3+發(fā)生絡合作用，形成絡合物[21]。

2.4.5 氧化劑與還原劑對色素穩(wěn)定性的影響

圖4 氧化劑與還原劑對色素穩(wěn)定性的影響Fig.4 Effect of oxidizing and reducing reagents on the stability of the pigments

選用常見的氧化劑H2O2和還原劑Na2SO3為代表，研究其對色素穩(wěn)定性的影響。結(jié)果如圖4所示，氧化劑和還原劑的存在會對色素的穩(wěn)定性造成影響，但這種影響并未隨著氧化劑和還原劑質(zhì)量濃度的增加而發(fā)生明顯的變化。

2.4.6 葡萄糖和蔗糖對色素穩(wěn)定性的影響

圖5 葡萄糖和蔗糖對色素穩(wěn)定性的影響Fig.5 Effect of sugars on the stability of the pigments

由圖5可知，葡萄糖和蔗糖對色素都有一定的增色效應，色素的吸光度有所增加。但是隨著糖質(zhì)量濃度的增加，色素吸光度的升高不太明顯，說明色素的耐糖性比較高。因此，食品行業(yè)中經(jīng)常使用的甜味劑可能對色素的穩(wěn)定性有影響。

2.4.7 食品添加劑對色素穩(wěn)定性的影響

實驗中配制質(zhì)量濃度為1g/100mL的苯甲酸鈉、檸檬酸和山梨酸鉀溶液，添加到色素酸性乙醇溶液中處理一段時間。表5表明，苯甲酸鈉、檸檬酸和山梨酸鉀的存在對色素具有增色作用。

表5 食品添加劑對色素穩(wěn)定性的影響Table 5 Effect of food additives on the stability of the pigments

3 結(jié) 論

以酸性乙醇(pH2)為提取溶劑，從一株新型鐮刀菌(Fusarium sp. B158)液態(tài)發(fā)酵菌絲體中提取得到色素，隨后對色素進行理化性質(zhì)研究。色素全波長掃描顯示，色素在波長200～700nm范圍內(nèi)有兩個吸收峰，分別為324nm和360nm，考慮到核酸和蛋白質(zhì)類物質(zhì)的影響，選擇360nm作為色素的最大檢測波長，用于色素含量的測定。色素的理化性質(zhì)研究表明，色素在紫外和可見光下都能穩(wěn)定存在并顯示其本色。中性醋酸鉛因能與色素結(jié)構(gòu)中的某些基團發(fā)生絡合反應而生成白色沉淀。經(jīng)氨水和碳酸鈉處理后，色素顏色發(fā)生變化，這可能與色素溶液的酸堿性的改變有關。濃鹽酸和濃硫酸因能增加色素溶液的酸性而對其顏色造成影響。色素在酸性條件下對熱、光以及甜味劑(葡萄糖、蔗糖)和常見食品添加劑(苯甲酸鈉、檸檬酸、山梨酸鉀)具有良好的穩(wěn)定性；大部分的金屬離子(Mg2+、Ca2+、Na+、K+、Al3+、Zn2+)對于該色素的穩(wěn)定性影響不大，Cu2+和Fe3+的存在因能造成色素結(jié)構(gòu)的改變而影響其穩(wěn)定性和顏色，F(xiàn)eCl3和色素反應有綠色沉淀生成，說明色素中含有游離酚羥基。色素溶液pH值的改變以及氧化劑H2O2和還原劑Na2SO3的存在對于色素的穩(wěn)定性影響較大。

[1]王君, 張寶善. 微生物生產(chǎn)天然色素的研究進展[J]. 微生物學通報, 2007, 34(3): 580-583.

[2]DUFOSSE L. Microbial production of food grade pigments[J]. Food Technology and Biotechnology, 2006, 44(3): 313-321.

[3]DUFOSSE L, GALAUP P, YARON A, et al. Microorganisms and microalgae as sources of pigments for food use: a scientific oddity or an industrial reality[J]. Trends in Food Science & Technology, 2005, 16 (9): 389-406.

[4]MAPARI S A, NIELSEN K F, LARSEN T O, et al. Exploring fungal biodiversity for the production of water-soluble pigments as potential natural food colorants[J]. Current Opinion in Biotechnology, 2005, 16 (2): 231-238.

[5]MAPARI S A, THRANE U, MEYER A S. Fungal polyketide azaphilone pigments as future natural food colorants[J]. Trends in Biotechnology, 2010, 28(6): 300-307.

[6]DHARMARAJ S, ASHOKKUMAR B, DHEVENDARAN K. Foodgrade pigments from Streptomyces sp. isolated from the marine sponge Callyspongia diffusa[J]. Food Research International, 2009, 42(4): 487-492.

[7]BAKER R A, TATUM J H. Novel anthraquinones from stationary cultures of Fusarium oχysporum[J]. Journal of Fermentation and Bioengineering, 1998, 85(4): 359-361.

[8]MUKHERJEE G, SINGH S K. Purification and characterization of a new red pigment from Monascus purpureus in submerged fermentation[J]. Process Biochemistry, 2010, 46(1): 188-192.

[9]趙婷, 林孔亮, 惠伯棣. 微生物源類胡蘿卜素研究進展[J]. 食品科學, 2010, 31(23): 461-467.

[10]李一葦, 張明. 鏈霉菌2ZLT產(chǎn)生的藍色素性質(zhì)研究[J]. 激光生物學報, 2008, 17(2): 202-205.

[11]NAGIA F A, El-MOHAMEDY R S R. Dyeing of wool with natural anthraquinone dyes from Fusarium oχysporum[J]. Dyes and Pigments, 2007, 75(3): 550-555.

[12]KOMBOONCHOO S, BECHTOLD T. Natural dyeing of wool and hair with indigo carmine (CI Natural Blue 2), a renewable resource based blue dye[J]. Journal of Cleaner Production, 2009, 17(16): 1487-1493.

[13]VELMURUGAN P, KAMALA-KANNAN S, BALACHANDAR V, et al. Natural pigment extraction from five filamentous fungi for industrial applications and dyeing of leather[J]. Carbohydrate Polymers, 2010, 79 (2): 262-268.

[14]UNAGUL P, WONGSA P, KITTAKOOP P, et al. Production of red pigments by the insect pathogenic fungus Cordyceps unilateralis BCC 1869[J]. Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology, 2005, 32(4): 135-140.

[15]BABITHA S, SOCCOL C R, PANDEY A. Solid-state fermentation for the production of Monascus pigments from jackfruit seed[J]. Bioresource Technology, 2007, 98(8): 1554-1560.

[16]YANG Hailong, XIAO Caixia, MA Wenxin, et al. The production of hypocrellin colorants by submerged cultivation of the medicinal fungus Shiraia bambusicola[J]. Dyes and Pigments, 2009, 82(2): 142-146.

[17]VELMURUGAN P, LEE Y H, VENIL C K, et al. Effect of light on growth, intracellular and extracellular pigment production by five pigment-producing filamentous fungi in synthetic medium[J]. Journal of Bioscience and Bioengineering, 2010, 109(4): 346-350.

[18]McLEAN M. The phytotoxicity of Fusarium metabolites: an update since 1989[J]. Mycopathologia, 1996, 133(3): 163-179.

[19]BERESTETSKIY A. A review of fungal phytotoxins: from basic studies to practical use[J]. Applied Biochemistry and Microbiology, 2008, 44 (5): 453-465.

[20]MEDENTSEV A, ARINBASARVA A Y, AKIMENKO V K. Biosynthesis of naphthoquinone pigments by fungi of the genus Fusarium[J]. Applied Biochemistry and Microbiology, 2005, 41(5): 503-507.

[21]龔盛昭. 天然食用色素的化學結(jié)構(gòu)和穩(wěn)定性的關系[J]. 廣州化工, 2002, 30(4): 11-13.

[22]周立國, 李連之. 天然色素的變質(zhì)原因及其提取應用中應注意的問題[J]. 聊城師院學報: 自然科學版, 1994, 7(3): 67-71.

Extraction and Physico-chemical Properties of Pigments from Liquid-Cultured Mycelia of Fusarium sp. B158

ZENG Xiang-long1，CAI Yu-jie1,*，LIAO Xiang-ru1，ZENG Xiang-kang1，LI Zhi-ling2，ZHANG Da-bing2
(1. Key Laboratory of Industrial Biotechnology, Ministry of Education, School of Biotechnology, Jiangnan University, Wuxi 214122, China；2. Jiangsu Hanbon Science and Technology Co. Ltd., Huai’an 223001, China)

In this work, pigments from the liquid-cultured mycelia of Fusarium sp. B158 were extracted and their physico-chemical properties were investigated. The best solvent for extracting pigments from the liquid-cultured mycelia of Fusarium sp. B158 was found to be acidified ethanol (pH = 2). The extract obtained showed maximum absorption at 324 nm and 360 nm. To facilitate further investigations, 360 nm was chosen as maximum absorption wavelength. The pigments were stable to heat, light, sugars and common food additives, but sensitive to pH, oxidizers and reductants. Most of the investigated metal ions (except Cu2+and Fe3+) revealed little effect on the pigments.

pigment；extraction；stability；Fusarium sp. B158

TS202.3

A

1002-6630(2012)03-0131-05

2011-03-09

中央高?；究蒲袠I(yè)務費專項資金資助項目(JUSRP21120)；國家自然科學基金項目(21045007)；江蘇省科技創(chuàng)新與成果轉(zhuǎn)化(重大科技支撐與自主創(chuàng)新)專項引導資金項目(BY2010117)

曾祥龍(1987—)，男，碩士研究生，研究方向為生物化學與分子生物學。E-mail：xianglongceng@gmail.com

*通信作者：蔡宇杰(1973—)，男，副教授，博士，研究方向為工業(yè)微生物。E-mail：yu_jie_cai@yahoo.com.cn