王 耀，曹際娟*，趙 昕，鄭秋月，王 剛，田 卓，史媛媛，曹遠(yuǎn)銀

(1. 沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院植物免疫研究所，遼寧 沈陽(yáng) 110161；2. 遼寧出入境檢驗(yàn)檢疫局，遼寧 大連 116001；3. 莊河出入境檢驗(yàn)檢疫局，遼寧 莊河 121013；4. 營(yíng)口出入境檢驗(yàn)檢疫局，遼寧 營(yíng)口 115000)

單增李斯特氏菌MALDI-TOF-MS鑒定與分型研究

王 耀1,2，曹際娟2,*，趙 昕2，鄭秋月2，王 剛2，田 卓3，史媛媛4，曹遠(yuǎn)銀1

(1. 沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院植物免疫研究所，遼寧 沈陽(yáng) 110161；2. 遼寧出入境檢驗(yàn)檢疫局，遼寧 大連 116001；3. 莊河出入境檢驗(yàn)檢疫局，遼寧 莊河 121013；4. 營(yíng)口出入境檢驗(yàn)檢疫局，遼寧 營(yíng)口 115000)

為建立單增李斯特氏菌的基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOF-MS)快速鑒定與分型方法，實(shí)驗(yàn)收集37株單增李斯特氏菌分離株，應(yīng)用MALDI-TOF-MS采集圖譜，獲取獨(dú)特的蛋白質(zhì)指紋圖譜，匯總成標(biāo)準(zhǔn)圖譜，建立單增李斯特氏菌鑒定數(shù)據(jù)庫(kù)。采用單增李斯特氏菌標(biāo)準(zhǔn)菌株進(jìn)行驗(yàn)證，表明鑒定結(jié)果的可信度很高。在數(shù)據(jù)庫(kù)信息的基礎(chǔ)上，對(duì)37株單增李斯特氏菌分離株進(jìn)行聚類分型。分型結(jié)果表明，在蛋白質(zhì)水平上，MALDITOF-MS可把37株單增李斯特氏菌分成9個(gè)型別。

單增李斯特氏菌；基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOF-MS)；鑒定；分型

單增李斯特氏菌為典型的胞內(nèi)寄生菌，能在巨噬細(xì)胞和上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和肝細(xì)胞內(nèi)增殖，是一種人畜共患病病原菌[1-2]。該菌可引起人和動(dòng)物患腦膜炎、腦炎、敗血癥及造成孕婦流產(chǎn)、死胎等疾病[3]。孕婦、新生兒、老年人和免疫缺陷者是易感人群[4]。食源性李斯特氏菌發(fā)病率雖不高，但死亡率可高達(dá)20%～50%[5]。WHO在20世紀(jì)90年代已將其列為食品四大致病菌之一[6]。該菌在自然界分布廣泛，以家畜、家禽為主要宿主，很容易污染食品而引起食物中毒和李斯特病暴發(fā)[7]。肉類、蛋類、禽類、海產(chǎn)品、乳制品、蔬菜等都已被證實(shí)是李斯特氏菌的感染源[8]。

經(jīng)典的單增李斯特氏菌檢測(cè)方法是進(jìn)行增菌、選擇性分離培養(yǎng)、初篩、鑒定等步驟。這種方法耗時(shí)長(zhǎng)，程序繁瑣，試劑和人力成本均較高。此外，還有免疫磁性分析法[9]、PCR法[10]、實(shí)時(shí)PCR法[11]等許多快速檢測(cè)方法?；|(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(matrix-assisted laser desorption ionisation time-of-flight mass spectrometry，MALDI-TOF-MS)是近幾年發(fā)展起來的一種新型軟電離生物質(zhì)譜。它能完成細(xì)菌多種成分的分析，包括蛋白質(zhì)、脂類、脂多糖和脂寡糖、DNA、多肽及其他能被離子化的分子。細(xì)菌含有一些成分，能給出唯一的質(zhì)荷比，因此可作為生物標(biāo)志分子進(jìn)行細(xì)菌的特異性鑒定。由于其具有快速、準(zhǔn)確、靈敏、分辨率高和高質(zhì)量檢測(cè)范圍等優(yōu)點(diǎn)，MALDI-TOF-MS已經(jīng)逐漸成為臨床診斷、食品生產(chǎn)、環(huán)境檢測(cè)以及軍事領(lǐng)域研究的一種有力手段[12]。但是細(xì)菌比對(duì)標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)庫(kù)的資源不足是其局限性之一[13]。目前，Biotyper數(shù)據(jù)庫(kù)仍需要不斷補(bǔ)充單增李斯特氏菌的特征譜圖。因此，本研究利用MALDI-TOF-MS軟件支持用戶自定義數(shù)據(jù)庫(kù)的特點(diǎn)，按統(tǒng)一的建庫(kù)標(biāo)準(zhǔn)，采集37株單增李斯特氏菌分離株的數(shù)據(jù)并獲得特征指紋圖譜，添加創(chuàng)建質(zhì)譜圖數(shù)據(jù)庫(kù)，并進(jìn)一步開展單增李斯特氏菌鑒定和分子分型研究。

表1 單增李斯特氏菌分離株信息一覽表Table 1 Details of 37 Listeria monocytogenes isolates tested in this study

1 材料與方法

1.1 材料

37株單增李斯特氏菌分離株用于建立MALDI-TOF-MS鑒定數(shù)據(jù)庫(kù)，具體信息見表1。標(biāo)準(zhǔn)菌株單增李斯特氏菌1a血清型ATCC 19111、2a血清型ATCC 19112、4a血清型ATCC 19114、4b血清型ATCC 19115、4e血清型ATCC 19118、不溶血型ATCC 15313、ATCC BAA-751、ATCC 7644購(gòu)自美國(guó)典型菌種保藏中心(ATCC)；不溶血型NCTC 10890購(gòu)自中國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)菌庫(kù)(NCTC)，用于驗(yàn)證所建立數(shù)據(jù)庫(kù)的鑒定可信度。

1.2 試劑與儀器

α-氰-4-羥基肉桂酸(α-cyano-4-hydroxy-cinnamic acid，CHCA)、乙腈(acetonitrile，ACN)、三氟乙酸(trifluoroacetic acid，TFA)、肽標(biāo)準(zhǔn)品、蛋白標(biāo)準(zhǔn)品 德國(guó)Bruker Daltonik GmbH公司；營(yíng)養(yǎng)瓊脂(nutrient agar，NA)、檢測(cè)樣品配制基質(zhì)的溶劑為ACN、TFA、水(體積比50:2.5:47.5)、標(biāo)準(zhǔn)肽溶液配制基質(zhì)的溶劑為ACN、TFA、水(體積比30:0.1:69.9)、MALDI-TOF-MS 基質(zhì)溶液(用溶劑將基質(zhì)配成飽和溶液，基質(zhì)溶液現(xiàn)用現(xiàn)配)美國(guó)BD公司；API-20E生化鑒定試劑盒 法國(guó)梅里埃公司。

Microflex LRF20基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜儀 德國(guó)Bruker Daltonik GmbH公司；PHOENIX-100全自動(dòng)細(xì)菌生化分析儀 美國(guó)BD公司。

1.3 方法

1.3.1 分離菌株的鑒定

本研究對(duì)收集到的單增李斯特氏菌分離株，經(jīng)API-20E生化鑒定和全自動(dòng)細(xì)菌生化分析儀鑒定，37株分離菌株均具有單增李斯特氏菌典型的生化特性，生長(zhǎng)旺盛，可用于建立MALDI-TOF MS鑒定數(shù)據(jù)庫(kù)。對(duì)這37株單增李斯特氏菌進(jìn)行唯一性編號(hào)，用于建立MALDITOF MS鑒定數(shù)據(jù)庫(kù)。

1.3.2MALDI-TOF-MS檢測(cè)

1.3.2.1 樣品處理與點(diǎn)樣

根據(jù)GB4789.30—2010《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 單核細(xì)胞增生李斯特氏菌檢驗(yàn)》取單增李斯特氏菌新鮮培養(yǎng)物，在Eppendorf管中加入300μL純凈水，挑取適量(5～10mg)菌體，混勻，再加入900μL無水乙醇，混勻后以13000r/min離心2min，棄去上清液，加入50μL 70%甲酸，混勻，再加入50μL乙腈，混勻，同樣以13000r/min離心2min，吸取上清液，涂布于96 孔樣品板上，自然晾干1h 后，用基質(zhì)溶液(CHCA)覆蓋菌苔，用標(biāo)準(zhǔn)肽溶液覆蓋校準(zhǔn)孔，每孔1μL。晾干5min 后進(jìn)樣。

MALDI-TOF-MS儀器參數(shù)為：線性操作模式，正離子模式；檢測(cè)分子質(zhì)量范圍：3000～13000D；激光點(diǎn)擊數(shù)：每個(gè)圖譜50；激光頻率：30.0Hz；離子源加速電壓：20kV。采用氮激電源，質(zhì)荷比(m/z)數(shù)據(jù)采集范圍為800～17378D。

1.3.2.2 數(shù)據(jù)采集

將上樣的樣品板小心置于板孔中，加有樣品一面朝上。蓋上蓋子，抽真空。打開儀器控制軟件FlexControl，調(diào)好儀器參數(shù)，校準(zhǔn)儀器。采集標(biāo)準(zhǔn)品及樣品的質(zhì)譜圖。對(duì)采集的數(shù)據(jù)進(jìn)行保存，每次實(shí)驗(yàn)前都要在采集數(shù)據(jù)的質(zhì)量范圍內(nèi)使用肽標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行校準(zhǔn)，校正后進(jìn)行質(zhì)譜數(shù)據(jù)采集，通過Biotyper軟件進(jìn)行分析鑒定。

1.3.2.3 建立數(shù)據(jù)庫(kù)

將單增李斯特氏菌分離株分別接種于NA培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)24h，得到新鮮菌株培養(yǎng)物。取每個(gè)菌株培養(yǎng)物再分別平行接種5個(gè)NA斜面，37℃培養(yǎng)24h，得到5個(gè)平行樣品。按1.3.2.1節(jié)的方法進(jìn)行樣品處理與點(diǎn)樣，每個(gè)平行樣品重復(fù)點(diǎn)兩個(gè)樣品孔。每株菌共點(diǎn)10個(gè)樣品孔。按1.3.2.2節(jié)的方法校準(zhǔn)儀器后，點(diǎn)擊樣品孔采集數(shù)據(jù)，每個(gè)樣品孔點(diǎn)擊10次，采集2個(gè)質(zhì)譜圖。每株菌可以采集20個(gè)質(zhì)譜圖。使用BioTyper軟件，分別調(diào)入所采集的每株單增李斯特氏菌的20個(gè)質(zhì)譜圖，將此20個(gè)質(zhì)譜圖匯總生成整合圖譜，對(duì)所得的圖譜進(jìn)行分析統(tǒng)一化，該圖譜便作為單增李斯特氏菌質(zhì)譜圖數(shù)據(jù)庫(kù)的標(biāo)準(zhǔn)圖譜。

1.3.3 結(jié)果判斷

鑒定結(jié)果給出數(shù)據(jù)庫(kù)中與鑒定菌種最為匹配的10個(gè)菌株種屬，并給出相對(duì)應(yīng)的分?jǐn)?shù)。匹配分?jǐn)?shù)在2.300～3.000之間，標(biāo)記為(＋＋＋)，表示菌種鑒定的可信度很高；在2.000～2.299之間，標(biāo)記為(＋＋)，表示保守的菌屬鑒定或可能的菌種鑒定；在1.700～1.999之間，標(biāo)記為(＋)，表示可能的菌屬鑒定；在0.000～1.699之間，標(biāo)記為(ˉ)，表示不可信的鑒定。

2 結(jié)果與分析

2.1 單增李斯特氏菌MALDI-TOF-MS鑒定數(shù)據(jù)庫(kù)的建立

本研究對(duì)供試37株單增李斯特氏菌分離株全部進(jìn)行了采集與圖譜匯總，建立標(biāo)準(zhǔn)圖譜，最終建成包含37株單增李斯特氏菌信息的獨(dú)立的鑒定數(shù)據(jù)庫(kù)，將其標(biāo)注編號(hào)為No.LMLNCJJ20100503。這37株單增李斯特氏菌分離株的主要離子峰基本一致，非常穩(wěn)定。以單增李斯特氏菌(SD-L-A5-6)為例，如圖1所示，經(jīng)MALDI-TOFMS分析，單增李斯特氏菌(SD-L-A5-6)主要離子峰為：m/z 3252.30、3702.88、4325.83、4878.28、6365.26、7405.70、9757.97。

圖1 MALDI-TOF-MS分析單增李斯特氏菌(SD-L-A5-6)的主要離子峰圖譜Fig.1 MALDI-TOF-MS spectrum of Listeria monocytogenes showing major ion peaks

為驗(yàn)證單增李斯特氏菌數(shù)據(jù)庫(kù)的鑒定效果，將9株單增李斯特氏菌標(biāo)準(zhǔn)菌株(ATCC 19111、ATCC 19112、ATCC 19114、ATCC 19115、ATCC 19118、ATCC 15313、ATCC BAA-751、ATCC 7644、NCTC 10890)分別進(jìn)行MALDI-TOF-MS鑒定，分析在數(shù)據(jù)庫(kù)中的匹配結(jié)果。經(jīng)鑒定，9株標(biāo)準(zhǔn)菌株的匹配分?jǐn)?shù)全部大于2.300，均報(bào)告為單增李斯特氏菌，表明鑒定結(jié)果的可信度很高。

2.237 株單增李斯特氏菌MALDI-TOF-MS聚類分型鑒定結(jié)果

通過模式匹配計(jì)算新數(shù)據(jù)庫(kù)(No.LMLNCJJ20100503)中37株單增李斯特氏菌主要譜圖的相似性，采用相似分值構(gòu)建系統(tǒng)樹，對(duì)37株菌進(jìn)行聚類分型分析。37株單增李斯特氏菌聚類分型樹狀圖如圖2所示。差異水平代表彼此間的親緣關(guān)系，其值在0到1.6之間。差異為0表示兩個(gè)MALDI-TOF-MS 質(zhì)譜圖完全相同，可歸屬為同一類；差異為1.6時(shí)表示兩株菌之間的親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。所選擇的差異水平不同，則單增李斯特氏菌被分型的數(shù)目不一。在差異水平為0.7～0.8之間時(shí)，MALDI-TOF-MS分型結(jié)果將37株菌分成4個(gè)型；在差異水平為0.5時(shí)，將37株菌分成7個(gè)型；在差異水平為0.3～0.4之間時(shí)，將37株菌分成9個(gè)型。

圖2 37株單增李斯特氏菌MALDI-TOF MS聚類分型樹狀圖Fig.2 Clustering dendrogram of 37 Listeria monocytogenes isolates

由圖2可見，從朝鮮進(jìn)口的凍章魚、海螺、青柳蛤、河螺、紫石房蛤、魷魚中分離出來的單增李斯特氏菌(編號(hào)為DD-L21、DD-L25、DD-L26、DD-L36、DD-L37、DD-L44)與從中國(guó)丹東的海鮮組合、魷魚中分離出來的單增李斯特氏菌(編號(hào)為DD-L51、DD-L58)屬于同一型，親緣關(guān)系非常近，表明這些菌株可能為同一個(gè)污染源，都來源于中國(guó)丹東和朝鮮邊境的鴨綠江水域。而從新西蘭進(jìn)口的凍帶魚(SD-DAH1-11)、中國(guó)廣東的鰻魚(GD-L26)中分離出來的單增李斯特氏菌，從分型結(jié)果來看，也與上述菌株具有比較近的親緣關(guān)系。

從中國(guó)丹東的魷魚、雜色蛤等5個(gè)樣品中分離出來的單增李斯特氏菌(編號(hào)為DD-L20、DD-L31、DD-L52、DD-L54、DD-L55)，與從朝鮮進(jìn)口的4個(gè)凍章魚樣品中分離出來的單增李斯特氏菌(編號(hào)為DD-L29、DD-L32、DD-L33、DD-L35)，屬于同一型，親緣關(guān)系非常近，表明這些菌株可能為同一個(gè)污染源，都來源于中國(guó)丹東和朝鮮邊境的鴨綠江水域。而山東出入境檢驗(yàn)檢疫局提供的從挪威進(jìn)口的凍雞肉中分離的單增李斯特氏菌(SD-L-A2-5)和來源信息不詳?shù)木?SD-L-A5-5)，從分型結(jié)果來看，也與上述菌株具有比較近的親緣關(guān)系。

廣東出入境檢驗(yàn)檢疫局從加拿大、美國(guó)、挪威、丹麥、印度、法國(guó)進(jìn)口的凍豬耳、凍雞爪、凍雞翅、凍魚、凍豬腳、帶魚、鴨翅中分離出來的單增李斯特氏菌(編號(hào)為GD-L12、GD-L15、GD-L16、GD-L17、GDL18、GD-L19、GD-L27、GD-L28)屬于同一型，親緣關(guān)系比較近，表明這些菌株可能為同一個(gè)污染源。而從廣東凍蝦仁中分離出來的單增李斯特氏菌(GD-L14)以及廣東出入境檢驗(yàn)檢疫局提供的來源信息不詳?shù)膬芍昃?GD-L5、GD-L6)，從分型結(jié)果來看也與上述菌株具有比較近的親緣關(guān)系。

此外，從挪威進(jìn)口的三文魚和中國(guó)廣州泥猛魚中分離出來的單增李斯特氏菌(編號(hào)分別為GD-L9、GD-L10)，卻與其他35株單增李斯特氏菌分離株都不屬于同一型，與它們的親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。

3 討 論

利用質(zhì)譜進(jìn)行細(xì)菌鑒定的研究始于30多年前[14]，但直到1988年Tanaka和Hillenkamp兩個(gè)研究組分別提出基質(zhì)輔助激光解吸電離這種“軟電離”方式，才使得質(zhì)譜技術(shù)應(yīng)用于生物大分子的分析得到飛躍性進(jìn)步[15]。其具有的高靈敏度、高準(zhǔn)確度及高分辨率等特點(diǎn)已使之成為生命科學(xué)研究領(lǐng)域的一種強(qiáng)有力的分析測(cè)試手段。曾有科學(xué)家預(yù)言，21 世紀(jì)是MALDI-TOF-MS 的世紀(jì)[16]。因?yàn)榈鞍踪|(zhì)在微生物體內(nèi)的含量較高，所以常被用于細(xì)菌屬、種和株的鑒定。MALDI-TOF-MS被用于分析蛋白質(zhì)及酶消化產(chǎn)物的研究也較多。如Dieckmann等[17]利用蛋白質(zhì)圖譜分析，建立了沙門氏菌在種和亞種水品的分類鑒定方法。徐昕榮等[18]利用MALDI-TOF-MS對(duì)生物脫氮廢水處理系統(tǒng)中分離得到的兩株細(xì)菌進(jìn)行蛋白質(zhì)質(zhì)量指紋圖譜分析，建立了生物脫氮細(xì)菌的快速鑒定方法。本研究通過采集37株單增李斯特氏菌分離株的數(shù)據(jù)并獲得特征指紋圖譜，創(chuàng)建了單增李斯特氏菌鑒定質(zhì)譜圖數(shù)據(jù)庫(kù)，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)單增李斯特氏菌的準(zhǔn)確鑒定。

本研究在建立單增李斯特氏菌數(shù)據(jù)庫(kù)的同時(shí)，還通過模式匹配計(jì)算數(shù)據(jù)庫(kù)中單增李斯特氏菌主要譜圖的相似性，構(gòu)建系統(tǒng)樹進(jìn)行分型，可以分析菌株之間的親緣關(guān)系，追溯可能的污染源。在以往的分型方法中，脈沖場(chǎng)電泳(pulsed field gel electrophoresis，PFGE)分型方法被譽(yù)為分子流行病學(xué)中的“金標(biāo)準(zhǔn)”[19]，其分辨率高，可區(qū)分不同菌株間的細(xì)微差別，其不足之處是實(shí)驗(yàn)技術(shù)較難掌握，且實(shí)驗(yàn)耗時(shí)，相應(yīng)的試劑費(fèi)用比較昂貴。MALDI-TOF-MS 和PFGE 分型分別代表了同一菌株基于蛋白質(zhì)和DNA 分型的兩個(gè)方面，二者結(jié)合使用可擴(kuò)大基因型對(duì)亞種水平的分型能力，是PFGE 方法的補(bǔ)充。

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Identification and Subtyping of Listeria monocytogenes by MALDI-TOF-MS

WANG Yao1,2，CAO Ji-juan2,*，ZHAO Xin2，ZHENG Qiu-yue2，WANG Gang2，TIAN Zhuo3，SHI Yuan-yuan4，CAO Yuan-yin1
(1. Institute of Plant Immunology, College of Plant Protection, Shenyang Agricultural University, Shenyang 110161, China；2. Liaoning Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Dalian 116001, China；3. Zhuanghe Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Zhuanghe 121013, China；4. Yingkou Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Yingkou 115000, China)

In order to establish a matrix-assisted laser desorption ionisation time-of-flight mass spectrometry (MALDI-TOFMS) method for the rapid identification and subtyping of Listeria monocytogenes, 37 Listeria monocytogenes isolates were tested using MALDI-TOF-MS and characteristic protein fingerprints from their spectra were acquired and summarized into standard spectra to construct a database for the identification of Listeria monocytogenes. The method was highly reliable as demonstrated by the results obtained by the method for standard Listeria monocytogenes strains. Based on the identification database constructed, the Listeria monocytogenes isolates were classed into 9 subtypes at the protein level.

Listeria monocytogenes；matrix-assisted laser desorption ionisation time-of-flight mass spectrometry(MALDITOF-MS)；identification；subtyping

Q503

A

1002-6630(2012)03-0194-05

2011-03-11

國(guó)家質(zhì)檢總局科研項(xiàng)目(2010IK175)；國(guó)家質(zhì)檢公益性行業(yè)科研項(xiàng)目(200910270)

王耀(1982—)，男，博士，研究方向?yàn)橛泻ι锱c環(huán)境安全。E-mail：wangyao_00@126.com

*通信作者：曹際娟(1968—)，女，研究員，博士，研究方向?yàn)槭称钒踩珯z驗(yàn)。E-mail：cjj0909@163.com