A154C/G155C雙點(diǎn)突變對(duì)嗜熱耐酸淀粉酶酶活性及熱穩(wěn)定性的影響

柯 濤，劉 征，楊建偉，牛秋紅，惠豐立，石晴芳，馬向東

(1.南陽(yáng)師范學(xué)院生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，河南 南陽(yáng) 473061；2.湖北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，湖北 武漢 430062)

A154C/G155C雙點(diǎn)突變對(duì)嗜熱耐酸淀粉酶酶活性及熱穩(wěn)定性的影響

柯 濤1，劉 征1，楊建偉1，牛秋紅1，惠豐立1，石晴芳2，馬向東2

(1.南陽(yáng)師范學(xué)院生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，河南 南陽(yáng) 473061；2.湖北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，湖北 武漢 430062)

利用重疊延伸法對(duì)嗜熱球菌Thermococcus sp.的高溫酸性α-淀粉酶基因BD5088進(jìn)行體外A154C/G155C雙點(diǎn)定點(diǎn)突變，通過(guò)原核表達(dá)載體pET30a構(gòu)建表達(dá)載體pET-BD5088C2，在大腸桿菌BL21(DE3)中表達(dá)，酶學(xué)性質(zhì)分析表明，突變淀粉酶拓寬了反應(yīng)pH值范圍，尤其是酸性條件下提高更為顯著。BD5088淀粉酶在100℃條件下酶活力半衰期約為22min，而突變酶酶活力半衰期40min，突變酶酶活力比BD5088淀粉酶提高近1倍。加熱60min時(shí)，突變酶酶活力仍可維持原活力的40%，而B(niǎo)D5088淀粉酶只能維持20%左右。說(shuō)明其熱穩(wěn)定性得到有效的提高。另外，突變酶在中溫和90℃條件下酶活力有所提高，65℃時(shí)酶活力提高將近1倍。結(jié)果表明，BD5088淀粉酶的154、155位殘基的突變?yōu)镃ys對(duì)維持其熱穩(wěn)定性起到重要的作用，并且對(duì)其酶學(xué)性質(zhì)有較大的影響，可能參與了二硫鍵的形成。

嗜熱耐酸淀粉酶；定點(diǎn)突變；熱穩(wěn)定性；二硫鍵

淀粉是由葡萄糖基組成的高分子聚合物，是發(fā)酵、制糖等工業(yè)中最重要的原料之一。現(xiàn)在主要采用的工藝是雙酶法，包括兩個(gè)步驟：液化和糖化，液化過(guò)程現(xiàn)廣泛采用噴射液化，淀粉大顆粒經(jīng)噴射液化器，在105～110℃的高溫下膠化，淀粉糊的自然pH值為3.5～4.2，因此液化過(guò)程需要將pH值調(diào)到6.0～6.2。在隨后的糖化過(guò)程中，糖化酶的最適作用溫度、pH值等均與淀粉酶不同。液化之后，需要將pH值調(diào)至4.2～5.0，溫度降為55～60℃，進(jìn)入糖化過(guò)程。因此，目前對(duì)工業(yè)用淀粉酶，尤其是燃料乙醇生產(chǎn)專用淀粉酶的研究熱點(diǎn)集中在極端嗜熱酸性淀粉酶的研究上。

大部分α-淀粉酶屬于糖苷水解酶家族GH-13亞家族，盡管淀粉酶家族成員的活性不同，但他們都來(lái)自一個(gè)共同的祖先，由多結(jié)構(gòu)域組成。所有家族成員都有TIM桶狀結(jié)構(gòu)作為催化結(jié)構(gòu)域 (A-domain)[1]。并且所有的酶也都有一個(gè)B結(jié)構(gòu)域，位于A結(jié)構(gòu)域的第3個(gè)β-折疊和α-螺旋之間。大部分超家族成員的催化結(jié)構(gòu)域有相同的保守區(qū)段[2-5]。已知這些保守區(qū)域不僅與α-淀粉酶的催化活性有關(guān)，而且也與α-淀粉酶家族共有的桶狀三級(jí)結(jié)構(gòu)的形成密切相關(guān)[6-7]。而不同的淀粉酶的B-domain的折疊類型差異較大，長(zhǎng)度從34～104不等[8]。

Richardson等[9]從環(huán)境微生物DNA文庫(kù)中克隆到的一系列可能來(lái)源于一種嗜熱球菌屬(Thermococcus)的高溫酸性α-淀粉酶基因，并通過(guò)定向進(jìn)化篩選到一個(gè)高溫酸性α-淀粉酶的人工突變體BD5088，在熒光假單胞菌Pseudomonas fluorescens獲得表達(dá)。基因BD5088全長(zhǎng)1311bp，編碼437個(gè)氨基酸，蛋白質(zhì)的理論分子質(zhì)量約48kD，肽鏈上不存在任何潛在N-連接糖基化位點(diǎn)[9]。最適pH4.5，最適溫度95℃，活性不依賴于Ca2+存在，是一種高溫酸性α-淀粉酶，其綜合性質(zhì)均優(yōu)于其他淀粉酶基因，具有較大的應(yīng)用潛力。為了能達(dá)到生產(chǎn)的目的，提高其熱穩(wěn)定性和耐酸性，本實(shí)驗(yàn)前期人工合成了BD5088基因，并在大腸桿菌中表達(dá)，研究表明其酶學(xué)性質(zhì)與Richardson等[9]在熒光假單胞菌中獲得的重組蛋白有一些差異，其最適溫度和pH值范圍分別為80℃和pH5.6。以人工合成的BD5088基因?yàn)槟０澹ㄟ^(guò)蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)和氨基酸序列保守性的分析和其他幾個(gè)已知的耐高溫淀粉酶基因進(jìn)行同源比對(duì)，在可變的B結(jié)構(gòu)域選擇待突變的氨基酸位點(diǎn)，利用定點(diǎn)突變技術(shù)，進(jìn)行定點(diǎn)突變，在大腸桿菌中進(jìn)行表達(dá)，驗(yàn)證其酶學(xué)性質(zhì)。

1 材料與方法

1.1 菌種與質(zhì)粒

大腸桿菌(Escherichia coli)DH5α、BL21(DE3)、T載體、大腸桿菌表達(dá)載體pET-30α 美國(guó)Invitrogen公司。

1.2 酶與試劑

BglⅡ、XhoⅡ、EcoRI、HindⅢ等限制性內(nèi)切酶、T4DNA聚合酶、T4DNA連接酶、Pyrobest DNA聚合酶、回收試劑盒、抗生素、DNA marker、蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)及其他化學(xué)試劑 寶生物工程(大連)有限公司；PCR引物合成和測(cè)序 上海Sangon公司。

1.3 培養(yǎng)基

篩選培養(yǎng)基是含100μg/mL卡那霉素的LB 瓊脂培養(yǎng)基。鑒定淀粉酶活性的培養(yǎng)基是在LB培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加1%淀粉和0.01%曲利苯蘭[10]。

1.4DNA的提取及操作

質(zhì)粒的快速提取、檢測(cè)及DNA的酶切、連接、大腸桿菌感受態(tài)的制備、轉(zhuǎn)化和表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE分析等按文獻(xiàn)[11]進(jìn)行。

1.5 定點(diǎn)突變及重組質(zhì)粒pET-BD5088C2的構(gòu)建和鑒定

根據(jù)反向重疊延伸PCR (overlap extension PCR)原理，設(shè)計(jì)一對(duì)突變引物A154/G155f：5＇ATTGCATtgttgtGAC TCCGGAACCTTC3＇和A154/G155rev：5＇GGAGTCacaaca ATGCAATTCATTTGGG 3＇。其中小寫(xiě)字母部分為突變位點(diǎn)。首先，以含有BD5088基因的質(zhì)粒pET-BD5088為模板，用引物A154/G155f和A154/G155rev，94℃，50s；62℃，45s；72℃，7min (30個(gè)循環(huán))，最后，72℃延伸10min，反向擴(kuò)增得到包含載體序列和基因序列的線性片段，經(jīng)過(guò)DpnⅠ酶消化模板后，膠回收，自連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，卡那霉素抗性平板篩選轉(zhuǎn)化子，測(cè)序鑒定是否為突變基因，命名該突變基因表達(dá)載體為pET-BD5088C2。

1.6 重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)和純化

將pET-BD5088C2、pET-BD5088和pET30a質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化E. coli BL21(DE3)，挑取單菌落分別接種于2mL LB (Kanamycin+)液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)過(guò)夜，按1%的接種量轉(zhuǎn)接于100mL培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)到OD值為0.6，加入IPTG至終濃度為1mmol/L，30℃誘導(dǎo)表達(dá)4h后，4℃、12000r/min離心5min收集菌體，將菌體重懸于pH5.6、0.2mmol/L的磷酸緩沖液中，超聲波破碎(功率400W，超聲10次，每次10s)，4℃、12000r/min離心15min，分別取樣用于SDS-PAGE，檢測(cè)蛋白表達(dá)情況。超聲波破碎后上清經(jīng)過(guò)90℃加熱后，離心去除沉淀，再用固化Ni2+樹(shù)脂進(jìn)行純化后用150mmol/L咪唑洗脫緩沖液洗脫，即得到純化的BD5088和雙點(diǎn)突變體A154C/G155C重組蛋白。

1.7 淀粉酶酶活力測(cè)定

純化后酶液用Yoo改良法[12]測(cè)定酶活力。酶活力單位定義為在最適反應(yīng)條件下，每分鐘水解1mg的淀粉所需的酶量。

1.8 α-淀粉酶酶學(xué)性質(zhì)研究

按照前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果，分別在不同溫度、pH5.6條件下測(cè)定酶活力，確定其作用的最適溫度。分別在不同pH值、80℃條件下測(cè)定酶活力，確定其作用的最適pH值。將酶液在95、100℃條件下分別處理不同時(shí)間，冰浴后再測(cè)定殘留酶活力，評(píng)價(jià)酶的熱穩(wěn)定性。

1.9 序列分析和同源建模

通過(guò)BLASTP搜索比對(duì)，找出與BD5088高度同源的蛋白質(zhì)序列和已知三維結(jié)構(gòu)的同源序列，用CLUSTALW程序進(jìn)行比對(duì)。三維結(jié)構(gòu)建模采用已知三維結(jié)構(gòu)的同源序列1MWO為模板，利用SWISS-MODEL程序進(jìn)行同源建模[13]。利用Compare3D工具進(jìn)行三維結(jié)構(gòu)間的比較和比對(duì)[14]。利用ConSurf-DB工具進(jìn)行氨基酸序列的進(jìn)化保守性分析[15]。

2 結(jié)果與分析

2.1 定點(diǎn)突變位點(diǎn)的選擇

通過(guò)序列的同源比對(duì)，發(fā)現(xiàn)和BD5088高度同源的基因均為古細(xì)菌淀粉酶基因，同屬糖苷水解酶GH13家族，選取同源序列中已知三維結(jié)構(gòu)的來(lái)源于Pyrococcus woesei的淀粉酶基因1MWO，進(jìn)行三維結(jié)構(gòu)的解析。通過(guò)氨基酸序列的進(jìn)化保守性分析(http://consurfdb.tau.ac.il/, The ConSurf-HSSP database)，可以看出，高度保守的殘基大部分位于桶狀結(jié)構(gòu)中間。而變異性高的殘基一般位于桶狀結(jié)構(gòu)的外層、B結(jié)構(gòu)域和C結(jié)構(gòu)域中。從對(duì)淀粉酶家族的結(jié)構(gòu)特征分析和催化活性位點(diǎn)分析，發(fā)現(xiàn)桶狀結(jié)構(gòu)內(nèi)部尤其是β-折疊內(nèi)高度保守的氨基酸與淀粉酶催化活性和維持桶狀結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性密切相關(guān)。對(duì)這些氨基酸的突變往往導(dǎo)致催化活性的喪失。因此，突變目標(biāo)首先選定為保守性相對(duì)較弱的氨基酸區(qū)域。

對(duì)幾個(gè)高度同源古細(xì)菌酸性淀粉酶間的氨基酸序列比對(duì)，BD5088與1MWO、Pfu_amylase、AAM48113分別有86.6%，86.5%和91.3%的同源性，具有較高的序列同源性。同時(shí)發(fā)現(xiàn)在154、155位點(diǎn)Pfu等3個(gè)高溫淀粉酶均為2個(gè)半胱氨酸，而B(niǎo)D5088淀粉酶則為A154/ G155，位于B結(jié)構(gòu)域中(圖1)。根據(jù)對(duì)1MWO蛋白三維結(jié)構(gòu)解析結(jié)果，推測(cè)此位點(diǎn)可能參與二硫鍵的形成，二硫鍵可加強(qiáng)淀粉酶的熱穩(wěn)定性，而其周圍4個(gè)氨基酸分別為Zn2+和Ca2+結(jié)合位點(diǎn)。因此認(rèn)為此位點(diǎn)的變化可能影響到該酶的熱穩(wěn)定性等性質(zhì)，本研究設(shè)計(jì)該位點(diǎn)為突變位點(diǎn)，構(gòu)建雙位點(diǎn)突變體A154C/G155C，觀察該位點(diǎn)對(duì)酶活力和熱穩(wěn)定性的影響。

圖1 BD5088序列同源比對(duì)結(jié)果Fig.1 Homologous alignment of BD5088 and other three amylases

2.2 突變基因A154C/G155C的獲得

以含有BD5088基因的質(zhì)粒pETBD5088為模板，用引物A154G155f和A154G155 rev，進(jìn)行反向重疊延伸PCR，反向擴(kuò)增得到片段為6.7kb的包含載體序列和基因序列的線性片段(圖2)，經(jīng)過(guò)DpnⅠ酶消化模板后，膠回收，自連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，篩選重組子，測(cè)序證明獲得雙位點(diǎn)突變基因A154C/G155C。并獲得了含有該突變基因的表達(dá)載體pET-BD5088C2。 2.3突變蛋白的的誘導(dǎo)表達(dá)

圖2 反向重疊延伸PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖Fig.2 Electrophoretic patterns of reverse overlap extension PCR products

將重組質(zhì)粒pET30a、pET-BD5088C2、pET-BD5088轉(zhuǎn)化到E. coli BL21(DE3)中，獲得重組菌株并進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，超聲波破碎后取樣進(jìn)行SDS-PAGE分析(圖3A)，表達(dá)出的目的蛋白分子質(zhì)量約為48kD，大小與理論值一致，經(jīng)過(guò)Ni+樹(shù)脂純化，得到純化后的重組酶(圖3B)。 2.4突變高溫酸性淀粉酶與BD5088淀粉酶的酶學(xué)性質(zhì)比較研究

圖3 表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE電泳分析Fig.3 SDS-PAGE of amylases from BD5088 and A154C/G155C

在pH5.6，不同的溫度條件下，測(cè)定BD5088和突變體A154C/G155C的酶活力，獲得溫度活力曲線。圖4A顯示，和BD5088淀粉酶相比，二者的最適反應(yīng)溫度范圍相似，為70～85℃。60～100℃之間相對(duì)酶活力可保持50%以上。突變酶在中溫范圍的酶活力高于BD5088淀粉酶(圖4A)。

在80℃，不同pH值條件下，測(cè)定BD5088淀粉酶和突變酶的酶活力，獲得pH值-活力曲線，圖4B顯示，BD5088淀粉酶的最適pH值范圍為5.6～6.0，在pH值5～6.4之間，相對(duì)酶活力在90%以上，pH值4.6以下失活。而突變酶在pH5.6以上時(shí)酶活力特性與BD5088淀粉酶相同，在酸性范圍內(nèi)其酶活力顯著優(yōu)于BD5088淀粉酶，pH4.6時(shí)可維持酶活力的78%。

對(duì)BD5088淀粉酶進(jìn)行熱穩(wěn)定性分析，分別在100℃條件下，對(duì)酶進(jìn)行加熱處理不同的時(shí)間。圖4C顯示，BD5088淀粉酶在100℃條件下酶活力半衰期約為22min，說(shuō)明該酶有較好的熱穩(wěn)定性。突變酶100℃條件下酶活力半衰期則提高到40min。加熱60min時(shí)，突變酶酶活力仍可維持原活性的40%。而B(niǎo)D5088淀粉酶只能維持20%左右。

圖4 A154C/G155C、BD5088淀粉酶的酶學(xué)性質(zhì)研究Fig.4 Enzymatic characteristics of amylases from BD5088 and A154C/G155C

2.5 三維結(jié)構(gòu)

BD5088與1MWO氨基酸順序有86.6%的同源性，三維結(jié)構(gòu)同源建模的結(jié)果表明，BD5088淀粉酶和其突變體A154C/G155C在三維結(jié)構(gòu)上與1MWO具有更高的相似度(圖5、6)。BD5088淀粉酶和突變酶三維結(jié)構(gòu)區(qū)別不大。突變位點(diǎn)位于B結(jié)構(gòu)域，因此對(duì)桶狀結(jié)構(gòu)影響不大。實(shí)驗(yàn)推測(cè)突變主要形成了二硫鍵，二硫鍵對(duì)蛋白結(jié)構(gòu)和功能的貢獻(xiàn)主要在于熱穩(wěn)定性上的提高，其溫度曲線未發(fā)生明顯改變。這符合研究熱穩(wěn)定性提高的預(yù)期。

圖5 突變體的同源建模三維結(jié)構(gòu)Fig.5 3D structure of A154C/G155C obtained by homology modeling

圖6 BD5088淀粉酶與A154C/G155C三維結(jié)構(gòu)同源建模后突變位點(diǎn)的比較(局部)Fig.6 Comparison of partial 3D structures of A154C/G155C and BD5088 showing mutation positions

3 討 論

隨著化石能源的日益枯竭和環(huán)境污染的日益嚴(yán)重，如何降低利用作物生產(chǎn)燃料乙醇等發(fā)酵產(chǎn)品的能源消耗受到了世界各國(guó)的高度重視。以淀粉質(zhì)為原料的液化和糖化工藝的幾個(gè)主要缺點(diǎn)就是pH值的反復(fù)調(diào)節(jié)、Ca2+的添加、105℃條件下淀粉酶活力的喪失，以及隨之而產(chǎn)生的后續(xù)處理工藝復(fù)雜等問(wèn)題。解決上述問(wèn)題的關(guān)鍵就是使用不依賴于鈣離子的超高溫酸性淀粉酶。顯然現(xiàn)有的耐高溫淀粉酶不能滿足上述工藝改進(jìn)要求。針對(duì)以上特點(diǎn)，國(guó)內(nèi)外對(duì)酶品種的改良方面的研究集中在耐高溫、耐酸性和非鈣離子依賴的淀粉酶的獲得上。雖然已經(jīng)取得了一定的成效，但真正3個(gè)特性完全滿足、并有高轉(zhuǎn)化率的酶的商品化生產(chǎn)仍然是個(gè)空白。而我國(guó)的耐高溫淀粉酶方面的研制仍無(wú)法與同類型國(guó)外產(chǎn)品相抗衡。到目前為止，在GenBank中登錄的耐酸性耐高溫淀粉酶的基因大部分來(lái)源于極端嗜熱古細(xì)菌，在耐高溫淀粉酶的生產(chǎn)技術(shù)路線方面，現(xiàn)一般都采用基因工程技術(shù)手段，經(jīng)過(guò)對(duì)極端環(huán)境微生物相關(guān)基因的蛋白質(zhì)工程改造，并構(gòu)建工程菌的技術(shù)路線，以避免原宿主菌難以培養(yǎng)或酶活力不高的缺點(diǎn)。目前已得到表達(dá)和細(xì)致研究，并在3種特性方面完全符合要求的淀粉酶基因還只有兩類基因，但距商品化應(yīng)用仍有距離。因此，對(duì)此類淀粉酶的開(kāi)發(fā)首先是相關(guān)的基因資源的開(kāi)發(fā)和對(duì)現(xiàn)有基因的改造。國(guó)內(nèi)多個(gè)課題組在原核和真核表達(dá)系統(tǒng)對(duì)此類基因進(jìn)行了表達(dá)和研究[16]，但很少有人進(jìn)行進(jìn)一步的基因改造工作。

通過(guò)對(duì)雙突變體酶活力的檢測(cè)，我們發(fā)現(xiàn)該位點(diǎn)的突變影響到該酶的溫度、pH值特性和熱穩(wěn)定性。兩個(gè)半胱氨酸的替換可能有利于該區(qū)域結(jié)構(gòu)上的穩(wěn)定，因此該突變體的熱穩(wěn)定性和耐酸性都有所提高。突變酶100℃條件下酶活力半衰期可提高近1倍。而在酸性范圍內(nèi)其酶活力也顯著優(yōu)于BD5088淀粉酶，pH4.6時(shí)從BD5088淀粉酶的完全喪失活力提高到可維持最適酶活力的78%。酸性的有效pH值范圍從pH4.6擴(kuò)大到pH3.8，比未突變酶擴(kuò)大了0.8個(gè)pH值。因此該雙突變體酶完全符合液化工序中對(duì)高溫淀粉酶的工藝要求，本研究用定點(diǎn)突變提高淀粉酶熱穩(wěn)定性及擴(kuò)大酶作用有效pH值范圍，將有利于淀粉酶的工業(yè)化生產(chǎn)及應(yīng)用。下一步工作我們可在此突變體基礎(chǔ)上進(jìn)一步選擇其他突變位點(diǎn)，以提高其酶比活力等酶學(xué)特征，逐步達(dá)到生產(chǎn)的要求。

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Effect of Double Site-Directed Mutagenesis on Amylase Activity and Thermostability from Thermococcus sp.

KE Tao1，LIU Zheng1，YANG Jian-wei1，NIU Qiu-hong1，HUI Feng-li1，SHI Qing-fang2，MA Xiang-dong2
(1.School of Life Science and Technology, Nanyang Normal University, Nanyang 473061, China；2.College of Life Science, Hubei University, Wuhan 430062, China)

Using overlap extension PCR, an A154C and G155C double site mutant named A154C/G155C was constructed based on the thermoacidophilic amylase gene BD5088 from Thermococcus sp. The recombinant plasmid pETBD5088C2 containing A154C/G155C was transformed into E. coli BL21 (DE3) for gene expression. The recombinant A154C/G155C amylase obtained showed a wider range of reaction pH, especially for acidic pH, than the amylase from BD5088. The half-life time of thermostability for the mutant at 100℃ was 22 min, almost doubling when compared with BD5088 (40 min). In addition, after heating for 60 min, A154C/G155C maintained 40% of its original amylase activity compared with 20% for BD5088, indicating an increase in thermostability. Moreover, the amylase activity of A154C/G155C increased at medium temperature or 90℃ and nearly doubled at 65℃. These results together with three-dimensional structure analysis indicate that mutation of the positions 154 and 155 to Cys in BD5088 is of great importance for maintaining the thermostability of amylase, has considerable effect on its enzymatic characteristics and may be involved in the formation of disulfide bonds.

thermoacidophilic amylase；site-directed mutagenesis；thermostability；disulfide bond

Q814.1

A

1002-6630(2012)03-0207-05

2011-02-21

湖北省教育廳重點(diǎn)課題資助項(xiàng)目(D20081004)；河南省教育廳自然科學(xué)研究計(jì)劃項(xiàng)目(2011B180039)；南陽(yáng)師范學(xué)院專項(xiàng)人才啟動(dòng)基金資助項(xiàng)目(nynu200748)

柯濤(1970—)，女，副教授，博士，研究方向?yàn)槊腹こ?、分子生物學(xué)。E-mail：ketao1@163.com