李栩文，于兆新，羅 俊

國產(chǎn)Goldeneye 20A試劑盒在精斑DNA檢測中應(yīng)用

李栩文，于兆新，羅 俊

目的探討國產(chǎn)Goldeneye 20A試劑盒在精斑DNA檢測中的效果。方法 利用202份強奸案件中的精斑檢材測試其效果。結(jié)果國產(chǎn)Goldeneye 20A試劑盒在精斑DNA檢驗中的效果明顯優(yōu)于美國AB公司IdentifilerTM試劑盒。結(jié)論在強奸案件精斑DNA的檢驗中，國產(chǎn)Goldeneye 20A試劑盒可以取代美國AB公司IdentifilerTM試劑盒。

混合斑；精斑；性侵犯；STR擴增

1 材料與方法

1.1 樣本202份強奸案件現(xiàn)場提取的精斑及混合斑檢材，其中男性精斑類63份（載體如床單、衛(wèi)生紙、避孕套等），混合斑類139份（載體如陰道擦拭物、受害女性內(nèi)褲、受害女性護(hù)墊等）。以上檢材全部經(jīng)過精斑確證實驗。

1.2 儀器與試劑GeneAmp?9700型遺傳分析儀（美國AB公司），3130型遺傳分析儀（美國AB公司），M48磁珠試劑盒（德國QIAGEN），IdentifilerTM試劑盒（美國AB公司），Goldeneye 20A試劑盒（中國基點認(rèn)知公司）。

1.3 方法 每份檢材取1份，放入1.5 m L的離心管中，用常規(guī)Chelex-100法提取模板DNA，用M48磁珠法純化模板DNA。

1.3.1 常規(guī)Chelex-100法 ①將檢材剪碎，放入1.5 m L離心管中，加1 000μL超純水，然后加入1／10體積的10%SDS至終濃度為1%，加蛋白酶K至終濃度40μL／m L，于37℃保溫2 h消化上皮細(xì)胞。②將消化后的混合物用套管法離心去載體，13 000 r／min，離心4 min，去掉上清，用超純水清洗沉淀。重復(fù)清洗2～3次。③干凈的精子沉淀物用200μL 5%Chelex-100溶液懸浮，加DTT（精子裂解液）和PK至終濃度分別為0.039 mol／L和100μL／m L，在旋渦振蕩器上振蕩7 s，56℃保溫1 h，振蕩7 s，96℃保溫10 m in后，振蕩7 s，13 000 r／m in下離心4 m in，以沉淀Chelex顆粒，上清液用于PCR反應(yīng)。

1.3.2 M48磁珠純化法 經(jīng)常規(guī)Chelex-100法提取的模板DNA。采用M48磁珠試劑盒（德國QIAGEN）純化。①模板DNA上清液200μL，加MTL液600μL、磁珠30μL，吸附10 m in，振蕩混勻；②將混勻液置磁力架上吸附，吸棄上清液，加入500 μL MW 1洗液，振蕩混勻；置磁力架吸附，吸棄上清液，用500μL 80%乙醇洗滌2次，吸棄上清液，56℃保溫5 m in（開蓋）；③50μL洗脫液從磁珠上振蕩洗脫DNA，65℃保溫10 m in，期間振蕩2～3次，置磁力架上吸附磁珠，吸取上清液用于PCR反應(yīng)。

1.3.3 擴增與分型 上述常規(guī)Chelex-100法提取的模板DNA，取1μL，分別用國產(chǎn)Goldeneye 20A系統(tǒng)和美國IdentifilerTM系統(tǒng)，10μL PCR反應(yīng)體系進(jìn)行擴增；M48磁珠純化法提取的模板DNA，取0.5μL，分別用國產(chǎn)GoldeneyeTM20A系統(tǒng)和美國IdentifilerTM系統(tǒng)，10μL PCR反應(yīng)體系進(jìn)行擴增。用3130型遺傳分析儀進(jìn)行STR分型。

2 結(jié)果

2.1 結(jié)果用常規(guī)常規(guī)Chelex-100法提取的模板DNA經(jīng)兩種試劑盒擴增后進(jìn)行STR分型的結(jié)果比較見表1；用M48純化后的DNA經(jīng)兩種試劑盒擴增后進(jìn)行STR分型的結(jié)果比較見表2。

表1 常規(guī)Chelex-100法提取兩種試劑盒擴增比較

表2 常規(guī)Chelex-100法提取DNA經(jīng)M 48磁珠純化后兩種試劑盒擴增比較

3 討論

3.1 耐受性法醫(yī)現(xiàn)場檢材中往往包含各種各樣的雜質(zhì)，部分雜質(zhì)通過常規(guī)的DNA提取方法很難去除，會殘留到最終得到的DNA溶液中，其中有些雜質(zhì)是PCR的抑制劑，會抑制Taq酶的活性或者阻礙Taq酶跟模板之間的結(jié)合，從而導(dǎo)致PCR擴增的失敗，這些雜質(zhì)通常被稱為“PCR抑制劑”，以上202份精斑檢材中混合斑常規(guī)Chelex-100法提取經(jīng)IdentifilerTM擴增檢測失敗的比例相對較大說明該試劑盒對“PCR抑制劑”的抵抗能力弱，而常規(guī)Chelex-100法提取經(jīng)國產(chǎn)GoldeneyeTM20A試劑盒擴增的混合斑檢出率卻非常高這是因為國產(chǎn)GoldeneyeTM20A試劑盒對大量的“PCR增強劑”進(jìn)行了篩選和比較，確定了合適的增強劑組合和濃度，以達(dá)到最大的消除“PCR抑制劑”抑制的作用，使得國產(chǎn)GoldeneyeTM20A對各種現(xiàn)場檢材中的“PCR抑制劑”都有相當(dāng)高的抵抗能力，具有廣泛的檢材適用性。

3.2 個體識別能力國產(chǎn)GoldeneyeTM20A試劑盒擴增19個STR基因座和一個性別基因座，兼容了當(dāng)前DNA身份鑒定主流試劑盒的全部STR基因座，提供了歷史數(shù)據(jù)的最大兼容性和最高精確度，提供了更多的信息量，具有更高的非父排除率和個體識別率。在個體識別能力上得到了進(jìn)一步增強幫助法醫(yī)們更準(zhǔn)確的判斷圖譜。

3.3 時間國產(chǎn)GoldeneyeTM20A試劑盒無需經(jīng)過純化就能取得完整的DNA分型圖譜比美國IdentifilerTM試劑盒更節(jié)省時間和減少不必要的檢驗流程，在刑事案件偵破中時間就是破案的關(guān)鍵。而減少不必要的檢驗流程能減少DNA損失及潛在污染，更高效地從一些微量檢材中提取到完整的DNA圖譜。

3.4 資金國外試劑盒價格高昂，為了檢出完整圖譜還要使用純化試劑盒提高了破案成本，而國產(chǎn)GoldeneyeTM20A試劑盒的價格只有國外試劑盒的1／3，并且一般不需要再使用M48磁珠試劑盒純化，節(jié)省了辦案經(jīng)費，提高了辦案質(zhì)量。

綜上所述在法醫(yī)刑事案件精斑檢材的檢驗中，國產(chǎn)GoldeneyeTM20A試劑盒個體識別能力強、節(jié)省試劑經(jīng)費、人力成本和檢驗時間。無論在技術(shù)指標(biāo)還是經(jīng)濟效益上完全可以替代國外試劑盒。

Dom estic Goldeneye 20A Kit in the Sperm DNA Detection

LIXu-wen，YU Zhao-xin，LUO Jun
（Kaifeng Public Security Bureau，Kaifeng 475000，China）

ObjectiveTo explore the domestic Goldeneye20A kit in semen stains in detection of DNA effect.Methods202 cases of rape by the semen samples to test its effect. Resu lts The domestic Goldeneye20A kit in the fine spot testing of DNA is obviously superior to the United States of America AB company IdentifilerTMkit.ConclusionIn cases of rape and sem inal stains DNA inspection，domestic Goldeneye20A kit can be replaced by the United States AB IdentifilerTMkit.

m ixed stains；semen stains；sexual assault；STR ampliferation精斑檢驗的主要目的與其他物證檢驗一樣，是為案件的偵查提供線索，為分析、審理案件提供證據(jù)。目前，在法醫(yī)領(lǐng)域已廣泛開展精斑的檢驗鑒定。但大部分公安機關(guān)DNA實驗室應(yīng)用的是國外的試劑盒，價格昂貴。國產(chǎn)Goldeneye 20A試劑盒經(jīng)我實驗室實驗驗證，受擴增抑制物影響小，質(zhì)量穩(wěn)定可靠，可以替代同類國外產(chǎn)品，降低了DNA檢驗成本，縮短了精斑DNA檢驗時間，實驗報告如下。

DF795.2

A

1672－688X（2012）04－0271－02

2012－07－18

開封市公安局，河南開封475000

李栩文（1982－），女，蒙古族，河南開封人，法醫(yī)師，從事DNA檢驗工作。