劉燕燕，楊 璇，韓 松，蘇吉兒，羅 宏，李俊發(fā)

（首都醫(yī)科大學(xué)神經(jīng)生物學(xué)系北京神經(jīng)科學(xué)研究所，北京 100069）

cPKCγ參與低氧預(yù)適應(yīng)對(duì)小鼠腦缺血皮質(zhì)內(nèi)CRMP2水解和磷酸化的調(diào)節(jié)

劉燕燕，楊 璇，韓 松，蘇吉兒，羅 宏，李俊發(fā)*

（首都醫(yī)科大學(xué)神經(jīng)生物學(xué)系北京神經(jīng)科學(xué)研究所，北京 100069）

目的 探討經(jīng)典型蛋白激酶Cγ（cPKCγ）在低氧預(yù)適應(yīng)（HPC）調(diào)節(jié)小鼠腦缺血皮質(zhì)內(nèi)腦衰反應(yīng)蛋白-2（CRMP2）水解和磷酸化中作用。方法 利用雄性BALB/c小鼠（18～22 g）HPC和大腦中動(dòng)脈阻塞（MCAO）模型，借助蛋白印跡、免疫共沉淀和免疫組化等生物化學(xué)技術(shù)，觀察cPKCγ激活對(duì)小鼠缺血腦皮質(zhì)內(nèi)CRMP2蛋白水解程度（BDP）和磷酸化水平（p-CRMP2）、cPKCγ-CRMP2相互作用和皮質(zhì)缺血半影區(qū)內(nèi)p-CRMP2陽性細(xì)胞數(shù)的影響。結(jié)果HPC顯著提高缺血腦皮質(zhì)半影區(qū)內(nèi)p-CRMP2水平，降低BDP產(chǎn)物形成（P＜0.05），而側(cè)腦室注射cPKCγ抑制劑Go6983（6nmol/L）可明顯解除HPC對(duì)半影區(qū)內(nèi)CRMP2蛋白水解和磷酸化的調(diào)節(jié)作用（P＜0.05）;免疫共沉淀結(jié)果提示，cPKCγ激活程度參與HPC對(duì)缺血腦皮質(zhì)半影區(qū)內(nèi)cPKCγ-CRMP2相互作用的調(diào)節(jié);同時(shí)，cPKCγ激活與HPC提高腦缺血半影區(qū)內(nèi)p-CRMP2陽性細(xì)胞數(shù)有關(guān)（P＜0.05）。結(jié)論cPKCγ參與HPC對(duì)小鼠缺血腦皮質(zhì)內(nèi)CRMP2水解與磷酸化的調(diào)節(jié)。

缺血/低氧預(yù)適應(yīng);大腦中動(dòng)脈阻塞;經(jīng)典型蛋白激酶C;腦衰反應(yīng)蛋白-2

*通信作者（corresponding author）:junfali@ccmu.edu.cn

腦卒中給人類健康和生命造成極大威脅，給患者帶來極大痛苦，給家庭及社會(huì)造成沉重負(fù)擔(dān)。因此，提高腦中風(fēng)的治療與預(yù)防水平、降低腦中風(fēng)的發(fā)病率，和死亡率顯得尤為重要。腦低氧預(yù)適應(yīng)（hypoxic preconditioning，HPC）是一種內(nèi)源性保護(hù)機(jī)制，能提高組織器官對(duì)缺血/低氧的耐受，對(duì)其機(jī)制及參與細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)通路的研究，對(duì)臨床治療腦缺血/低氧損傷具有重要指導(dǎo)意義。腦衰反應(yīng)調(diào)節(jié)蛋白2（CRMP2）是最早被發(fā)現(xiàn)的CRMPs家族成員，被認(rèn)為是semaphorin3A介導(dǎo)的生長錐塌陷信號(hào)通路中關(guān)鍵細(xì)胞內(nèi)信號(hào)蛋白［1］。本實(shí)驗(yàn)室發(fā)現(xiàn)腦HPC后經(jīng)典型蛋白激酶Cγ（cPKCγ）的激活水平增加，借助蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)曾發(fā)現(xiàn)HPC后cPKCγ-CRMP2相互作用明顯增強(qiáng)［2］;側(cè)腦室注射 TAT-CRMP2可減少 CRMP2水解同時(shí)提高p-CRMP2水平，并在一定程度上減輕腦缺血損傷［3］。據(jù)此，本實(shí)驗(yàn)擬利用小鼠HPC和腦中動(dòng)脈阻塞（middle cerebral artery occlusion，MCAO）腦缺血模型，探討cPKCγ對(duì)腦HPC對(duì)小鼠缺血腦皮質(zhì)內(nèi)CRMP2水解和磷酸化的調(diào)節(jié)。

1 材料與方法

1.1 材料

清潔級(jí) BALB/c小鼠［雄性，18～22 g，8～10周，首都醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物部，許可證編號(hào):SCXK-（軍）2007-004］;兔源性 cPKCγ、CRMP2 抗體（一抗，Santa Cruze公司）和p-CRMP2抗體（Abcam公司）;鼠源性β-actin單克隆抗體（Sigma公司）;辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔抗體和山羊抗鼠抗體（二抗）和ECL反應(yīng)底物（Chemicon公司）和Gel Doc凝膠成像分析系統(tǒng)（Bio-Rad公司）;BCA蛋白定量試劑盒（Pierce公司）;Kodak BioMaxMR X-光片（Kodak公司）;蛋白酶抑制劑（AEBSF，Leupeptin，Aprotinin，Pepstatin A和Chymostrypsin）、磷酸酶抑制劑（KF，Okadaic acid，Sodium pyrophosphate 和 Sodium orthovanadate）、Sodium deoxycholate、DTT、NP-40、EDTA、EGTA和SDS等試劑（Sigma公司）;小鼠線栓（頭端直徑為0.23 mm，沙東生物技術(shù)有限公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和模型制備

按本室已建方法制備小鼠 HPC模型［4］。在HPC后1 h，行小鼠MCAO腦缺血模型制備以及側(cè)腦室注射［5］。簡述如下:腹腔注射戊巴比妥鈉（0.6 g/kg）麻醉小鼠，顯微鏡下游離左側(cè)頸總動(dòng)脈、頸外動(dòng)脈及頸內(nèi)動(dòng)脈，結(jié)扎頸總動(dòng)脈的近心端和頸外動(dòng)脈的遠(yuǎn)心端;將頭端直徑0.23 mm、主干直徑0.18 mm的栓塞線，由頸外動(dòng)脈插入至大腦中動(dòng)脈 （深度約12.0 mm），并固定線栓。假手術(shù)組只進(jìn)行手術(shù)操作，不插入線栓。整個(gè)手術(shù)過程平均20 min完成，此間保持小鼠體溫，術(shù)后放入有清潔墊料的飼養(yǎng)盒中，自由飲水、進(jìn)食。小鼠在麻醉后固定小鼠于腦立體定位儀上，局部用利多卡因局麻后行正中切口。按側(cè)腦室的體表投影，以前囟為零點(diǎn)，在前囟后2.0 mm，左側(cè)1.0 mm和3.5 mm深度用微量注射器將5 μL cPKCγ抑制劑 Go6983（6 nmol/L）或滅菌二甲基雙砜 （DMSO）分別緩慢地注入到小鼠左側(cè)腦室。將動(dòng)物分為常氧假手術(shù)（sham）、缺血 （I）、低氧預(yù)適應(yīng) （HPC）+I、HPC 1 h后側(cè)腦室注射Go6983或DMSO后再行缺血五組。小鼠飼養(yǎng)條件為22±2℃、相對(duì)濕度55% ±3%，自由進(jìn)食進(jìn)水，手術(shù)前12 h禁食。

1.3 免疫沉淀

選取小鼠皮質(zhì)層組織不同蛋白組分，進(jìn)行操作如下:首先取蛋白質(zhì) G-Agarose 30 μL進(jìn)行預(yù)洗，加入IP緩沖液500 μL，輕輕搖洗，4℃ 12 000×g離心40 s后，棄上清，重復(fù)3次;然后，取總蛋白500 μg，蛋白質(zhì) G-Agarose 30 μL，加 IP 緩沖液至500 μL，于脫色搖床4℃孵育1 h;4℃ 12 000×g離心40 s后，保留上清 （以排除與蛋白質(zhì)G-Agarose非特異性結(jié)合蛋白）。上清內(nèi)加入相應(yīng)抗體1～5 μg和蛋白質(zhì)G-Agarose 30 μL，室溫下脫色搖床上孵育過夜。4℃ 12 000×g離心40 s后，棄上清，在沉淀中加入 IP緩沖液500 μL輕輕搖洗，4℃12 000×g離心40 s后，棄上清，重復(fù)3次。最后，在沉淀中加入100 mmol/L甘氨酸 （pH=3.0）100 μL，輕 輕 震 蕩，90℃ 加 熱 變 性 5 min，12 000×g離心40 s，吸取上清，用1.5 mol/L Tris-Cl（pH=8.8）緩沖液調(diào)節(jié)上清液的pH至中性;或在沉淀中加入100 μL thiourea緩沖液，振蕩5 min，離心取上清保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 免疫組織化學(xué)（DAB法）

將小鼠用1%戊巴比妥鈉進(jìn)行腹腔麻醉，沿胸旁正中線切開皮膚、剪斷肋骨、暴露心臟。在心尖處剪開左心室，插入灌流導(dǎo)管至升主動(dòng)脈，剪開右心耳。先用0.9%NaCl溶液灌流，每只小鼠約20 mL;血液沖凈后用4%多聚甲醛固定液灌流，每只小鼠100 mL，持續(xù)30 min。取腦，放入4%多聚甲醛固定液中后固定4～6 h，再放入20%的蔗糖溶液中脫水后，冰凍切片機(jī)中切片。DAB顯色，鏡下觀察染色結(jié)果。

1.5 免疫組化p-CRMP-2陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)方法

在高倍視野下對(duì)小鼠大腦皮質(zhì)組織內(nèi)染色完整細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。每只動(dòng)物選取5張腦片，每張腦片選取8個(gè)高倍視野，取平均值。計(jì)算出每高倍視野中染色完整細(xì)胞的細(xì)胞數(shù)。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS for Windows11.5統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素發(fā)差分析，結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

Western Blot結(jié)果應(yīng)用Quantity One分析軟件進(jìn)行半定量分析。所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均通過獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)和單因素方差分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。

2 結(jié)果

2.1 cPKCγ參與了HPC對(duì)缺血皮質(zhì)半影區(qū)內(nèi)CRMP2水解及磷酸化的調(diào)節(jié)

MCAO 6 h后，各實(shí)驗(yàn)組CRMP2的總蛋白量未發(fā)現(xiàn)明顯變化;I組小鼠的腦皮質(zhì)半影區(qū)內(nèi)CRMP2磷酸化水平下降，并且出現(xiàn)了大量剪切片段;HPC處理組腦缺血皮質(zhì)半影區(qū)CRMP2剪切片段減少，磷酸化水平增高;應(yīng)用Go6983（6nmol/L）則一定程度上了削弱了HPC對(duì)CRMP2磷酸化以及剪切片段的影響（圖1）。

2.2 cPKCγ活性對(duì)cPKCγ-CRMP2相互作用影響

cPKCγ與CRMP2之間存在相互作用，缺血后二者相互作用減弱，而HPC一定程度上可能減輕缺血對(duì)二者相互作用影響;應(yīng)用Go6983后，HPC對(duì)缺血所致cPKCγ與CRMP2之間相互作用的影響可能被部分消除，提示cPKCγ與CRMP2之間相互作用可能與cPKCγ激活水平有關(guān)（圖2）。

2.3 HPC和cPKCγ抑制劑Go6983（6 nmol/L）對(duì)小鼠腦缺血皮質(zhì)半影區(qū)內(nèi)p-CRMP2陽性細(xì)胞數(shù)的影響

HPC可減輕因腦缺血所致的p-CRMP2陽性細(xì)胞數(shù)目減少;應(yīng)用Go6983則可取消HPC對(duì)腦缺血皮質(zhì)半影區(qū)p-CRMP2陽性細(xì)胞的影響（圖3）。

3 討論

HPC是一種內(nèi)源性保護(hù)現(xiàn)象，人們發(fā)現(xiàn)PKCs的激活是預(yù)適應(yīng)形成的關(guān)鍵因素［6］。cPKCγ是神經(jīng)組織特有的蛋白激酶C家族成員，以往研究報(bào)道HPC能緩解缺血刺激引起的cPKCγ激活水平下降［7］。cPKCγ的激活在缺血中的作用在國際上是存在爭議的，本實(shí)驗(yàn)既往研究結(jié)果證明cPKCγ的膜轉(zhuǎn)位水平升高可能參與了HPC對(duì)腦缺血的腦保護(hù)作用，這可能是因?yàn)楸舜酥g研究的缺血時(shí)間點(diǎn)不同有關(guān)。

借助蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)發(fā)現(xiàn)，HPC后cPKCγ與CRMP2相互作用明顯增加。CRMP2是最早發(fā)現(xiàn)的CRMPs家族成員，在成熟腦組織中的表達(dá)量最高，可以與多種蛋白發(fā)生相互作用［8－10］，并可能參與神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)生發(fā)展。有報(bào)道CRMP2是Rho、CDK5和GSK3的底物，并參與了生長錐的塌陷，軸突生長，缺血和阿爾茨海默病等［11－12］。然而，對(duì)于CRMP2的正常生理和病理功能還不清楚。研究表明，腦內(nèi)CRMP2可與神經(jīng)纖維瘤蛋白存在相互作用，提示其可能在神經(jīng)元的發(fā)生過程中起作用［13］。有多個(gè)研究小組初步探討了CRMP2在腦缺血，神經(jīng)毒性和外傷創(chuàng)傷中的變化。利用雙向電泳技術(shù)分析了大腦中動(dòng)脈阻塞24 h后缺血皮質(zhì)內(nèi)蛋白質(zhì)組學(xué)的變化情況，發(fā)現(xiàn)CRMP2表達(dá)明顯升高［14］。在神經(jīng)毒素和創(chuàng)傷腦損傷過程中，CRMP2可被calpain-2所降解［15］，其降解片段（BDP）隨著損傷或處理時(shí)間的延長而增加。檢測新生鼠腦經(jīng)低氧-缺血（HI）處理后CRMP2的變化，發(fā)現(xiàn)HI可導(dǎo)致CRMP2的低磷酸化狀態(tài)，其低磷酸化可能是由于上游的激酶CDK5被抑制所致［16］。利用缺血再灌注模型研究發(fā)現(xiàn)Ca2+/鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶II（CaMKII）增加，p-CRMP2水平增加，可能介導(dǎo)腦缺血軸突的損傷作用［17］。本實(shí)驗(yàn)室既往研究發(fā)現(xiàn)小鼠腦缺血損傷6 h后CRMP2水解片段增加，磷酸化水平降低。本實(shí)驗(yàn)通過Western blot技術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)HPC可顯著提高缺血腦皮質(zhì)半影區(qū)內(nèi)p-CRMP2水平，降低BDP產(chǎn)物形成，而側(cè)腦室注射 cPKCγ抑制劑 Go6983（6 nmol/L）可明顯解除HPC對(duì)半影區(qū)內(nèi)CRMP2蛋白水解和磷酸化的調(diào)節(jié)作用;免疫共沉淀結(jié)果表明cPKCγ激活程度參與HPC對(duì)缺血腦皮層半影區(qū)內(nèi)cPKCγ-CRMP2相互作用的調(diào)節(jié);同時(shí)，免疫組化進(jìn)一步證實(shí)，cPKCγ激活與HPC提高腦缺血半影區(qū)內(nèi)p-CRMP2陽性細(xì)胞數(shù)有關(guān)。

圖1 cPKCγ參與HPC對(duì)缺血腦皮質(zhì)半影區(qū)內(nèi)CRMP2磷酸化和水解的調(diào)節(jié)Fig 1 cPKCγ involved in the regulation of hypoxic preconditioning on CRMP2 hydrolysis and phosphorylation in cerebral ischemic mice

圖2 小鼠腦皮質(zhì)半影區(qū)cPKCγ活性對(duì)CRMP2-cPKCγ相互作用影響Fig 2 The activity of cPKCγ affect the interaction between cPKCγ and CRMP2 in the peri-infarct region of cerebral ischemic mice

圖3 HPC和cPKCγ抑制劑Go6983（6 nmol/L）對(duì)MCAO所致小鼠腦皮質(zhì)半影區(qū)內(nèi)p-CRMP2陽性細(xì)胞數(shù)的影響Fig 3 Effects of HPC and cPKCγ inhibitor Go6983（6 nmol/L）on the MCAO-induced p-CRMP2 positive cells loss in peri-infarct area of mice

本實(shí)驗(yàn)研究提示，cPKCγ參與低氧預(yù)適應(yīng)對(duì)小鼠腦缺血皮層內(nèi)CRMP2水解和磷酸化的調(diào)節(jié)，這種作用很可能是cPKCγ通過增加CRMP2磷酸化，減輕其水解來介導(dǎo)的。但是，cPKCγ是否可直接磷酸化CRMP2，cPKCγ-CRMP2信號(hào)通路在腦缺血/低氧性損傷和適應(yīng)中的作用如何都有待進(jìn)一步探討。

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cPKCγ is involved in the regulation of hypoxic preconditioning on CRMP2 hydrolysis and phosphorylation in ischemic cortex of mice

LIU Yan-yan，YANG Xuan，HAN Song，SU Ji-er，LUO Hong，LI Jun-fa*

（Dep.of Neurobiology and Beijing Institute for Neuroscience，Capital Medical University，Beijing 100069，China）

ObjectiveTo explore the role of cPKCγ in hypoxic preconditioning（HPC）regulating hydrolysis and phosphorylation of collapsin response mediated protein 2（CRMP2）in the ischemic cortex of mice.MethodsUsing our established HPC and middle cerebral artery occlusion（MCAO）BALB/c mouse models（male，18 ～22 g），We applied Western blot，immunoprecipitation（IP）and immunohistochemisty to determine the effect of cPKCγ activation on CRMP2 hydrolysis and phosphorylation，cPKCγ-CRMP2 interaction and p-CRMP2 positive cells'number in the peri-infarct region of MCAO mice.ResultsHPC inhibited the decrease of p-CRMP2 level and the increase of BDP in peri-infarct region of ischemic cortex.Pretreatment of cPKCγ inhibitor Go6983（6nmol/L）could depress the HPC-induced inhibitory effect on CRMP2 dephosphorylation and hydrolysis in peri-infarct area of ischemic cortex;IP results showed that the activity of cPKCγ could affect the interaction between cPKCγ and CRMP2;in addition，the immunohistochemistry results also demonstrated the same effect of cPKCγ on p-CRMP2 positive cells in peri-infarct region of ischemic cortex.ConclusionscPKCγ is involved in the regulation of HPC on CRMP2 phosphorylation and hydrolysis in ischemic cortex of MCAO mice.

HPC;middle cerebral artery occlusion;cPKCγ;CRMP2

R339.5

A

1001-6325（2012）01-0025-06

2011－10－09

2011－11－23

國家自然科學(xué)基金（30871219，31071048，31171147）;973計(jì)劃前期專項(xiàng)（2011CB512109）;教育部高等學(xué)校博士點(diǎn)科研基金（20091107110001）;北京市屬高等學(xué)校人才強(qiáng)教深化計(jì)劃創(chuàng)新人才資助（PHR 200906116）