王鳳羽 馬林先 李聰敏 常明秀 豐慧根 張金枝 孟 麗 王玉偉 劉治佑

1.河南省人口和計劃生育科學(xué)技術(shù)研究院，河南省出生缺陷干預(yù)技術(shù)研究重點實驗室(鄭州，450002);2.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院生命科學(xué)技術(shù)系;3.河南省胸科醫(yī)院

先天性心臟病(CHD)是胚胎在發(fā)育過程中由于心臟、血管發(fā)育障礙所致的心臟血管形態(tài)、結(jié)構(gòu)、功能、代謝上的異常［1］。22q11.2微缺失綜合征是迄今為止少數(shù)已明確的CHD病因之一。22q11微缺失區(qū)域位于 D22S427/1638和 D22S306/308之間，大小為1.5～3 Mb。目前普遍認為，缺失發(fā)生的原因是染色體減數(shù)分裂后重組時出現(xiàn)不對稱和異常。Saita等［2］對20個DGS/VCFS家系22q11.2區(qū)域的3Mb片斷進行了研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)單倍體重組時同源染色體近端內(nèi)部交換現(xiàn)象極為普遍。此外，22q11區(qū)域的低重復(fù)拷貝序列(LCRs)間錯誤結(jié)合也可導(dǎo)致一對染色體重排，其中一條發(fā)生缺失。本研究運用多重鏈接依賴式探針擴增技術(shù)(MLPA)對CHD患兒進行22q11微缺失檢測，了解其在CHD患兒中的發(fā)生情況，探討 MLPA用于臨床診斷22q11微缺失的應(yīng)用價值，為CHD的優(yōu)生咨詢和產(chǎn)前診斷提供依據(jù)。

1 對象與方法

1.1 研究對象

隨機選取2010年6月～2011年5月河南省胸科醫(yī)院小兒心胸外科CHD患兒120例為研究對象。其中男性58例，女性62例;年齡6個月～12歲;相互之間均無親緣關(guān)系。所有病例均經(jīng)臨床、心臟彩超、手術(shù)確診，且采用細胞培養(yǎng)的方法進行染色體核型分析，未發(fā)現(xiàn)異常。本研究標本使用均得到患兒家屬知情并同意。60例無CHD家族史的河南漢族正常兒童作為正常對照。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA提取與檢測 用醋酸鉀沉淀蛋白質(zhì)，異丙醇沉淀基因組DNA，TE溶解。紫外分光光度計檢測DNA濃度及質(zhì)量，A260/A280=1.8，A260/A230＞2，TE 溶液稀釋至 50ng/μl的終濃度，－20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 MLPA檢測 采用荷蘭 MRC－Holland公司生產(chǎn)的MLPA P250試劑盒，共48個探針，其中29個位于22q11上，其余19個位于22q11以外，作為對照探針。22q11.2 LCR缺失核心區(qū)域探針共24個，分布見圖1。所有的反應(yīng)在熱蓋溫度為105℃的聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)儀上進行。

圖1 22q11.2 LCR A－G區(qū)域的大小及探針分布情況

1.2.3 多重探針雜交 取待測DNA 150ng置于PCR管中，加H2O 至5μl，于PCR 儀上98℃變性5min，快速降溫，25℃ 維持。取出PCR管，加入多重探針及MLPA 緩沖液各 1.5μl，充分混勻后，95℃ 變性1min，60℃雜交 16h，54℃維持。

1.2.4 多重探針鏈接 在上述PCR管內(nèi)加入鏈接酶1μl及連接酶緩沖液 A、B各3μl，再加入 H2O 25μl。配成40μl反應(yīng)體系，54℃ 反應(yīng) 15min，隨后98℃ 5min滅活鏈接酶。

1.2.5 多重PCR反應(yīng) 取上述鏈接產(chǎn)物10μl，分別加入4μl SALSA PCR 緩沖液、26μl H2O，配成 40μl反應(yīng)體系進行 PCR擴增，擴增條件為:95℃ 30s，60℃ 30s，72℃ 60s，35 個循環(huán)。72℃ 延伸 20min，15℃維持。

1.3 毛細管電泳檢測

取2μl PCR 產(chǎn)物，分別加入32μl SLS，0.3μl D1maker，混勻，利用遺傳分析儀(BECKMAN CEQ 8800)對擴增產(chǎn)物進行毛細管電泳和采集數(shù)據(jù)。

1.4 MLPA產(chǎn)物分析及結(jié)果判定

將CEQ System分析后的數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換為Excel格式，所得數(shù)據(jù)通過Coffalyser v9.4軟件(Holland－MRC公司)進行分析，得出基因相對拷貝數(shù)比值。根據(jù)試劑盒說明書，0.3﹤比值﹤0.7，表示該探針所檢測基因片段存在雜合缺失;0.7﹤比值﹤1.3，表示該基因片段無缺失;0﹤比值﹤0.3，表示該探針檢測的片段純合子缺失;比值﹥1.3表示該檢測區(qū)域存在重復(fù)片段。

2 結(jié)果

2.1 一般情況

本次研究的120例CHD患兒中，室間隔缺損占35.8%(43/120)，法洛四聯(lián)癥占 19.2%(23/120)，房間隔缺損占10%(12/120)。另外還有房室間隔缺損，室間隔缺損伴卵圓孔未閉，室間隔缺損伴肺動脈狹窄等其它復(fù)合類型。

2.2 檢測結(jié)果

120例CHD患兒中，檢出22q11缺失10例，占8.33%;檢出 22q11重復(fù) 1例，占 0.83%;剩余 109例患兒未檢測到異常，占90.84%。所有陽性標本均進行了3次重復(fù)實驗，所得結(jié)果一致。見圖2，表1。10例22q11缺失中，3Mb缺失9例，2Mb缺失1例，包括室間隔缺損3例，法洛四聯(lián)癥5例，肺動脈狹窄1例，右室雙出口1例。另外，檢測到小片段重復(fù)1例，CHD類型為肺動脈狹窄。見表2。

圖2 MLPA P250試劑盒檢測結(jié)果

表1 MLPA陽性病例的基因相對拷貝數(shù)比值

3 討論

CHD占據(jù)了出生缺陷疾病的1/3，WHO統(tǒng)計資料顯示，全球每年約有150萬兒童出生時患DHD，在足月和活產(chǎn)的新生兒中CHD的發(fā)病率為4‰～8‰，在早產(chǎn)兒、死產(chǎn)或流產(chǎn)病例中發(fā)病率更高［3］。我國CHD患病率為2.24‰ ～13.8‰，較嚴重的CHD多伴有心外畸形及多種功能障礙，如腭裂、唇裂、免疫功能下降、語言障礙、身體和智力發(fā)育不良等。CHD患病率居高不下，已成為影響兒童身心健康及人口生存質(zhì)量的重大公共衛(wèi)生問題，給社會和家庭造成了嚴重的經(jīng)濟和精神等方面的負擔(dān)。因此，研究CHD的病因，進一步開展CHD的優(yōu)生咨詢和產(chǎn)前診斷具有重要意義。

本研究應(yīng)用MLPA，對120例不同表型的CHD患兒進行22q11微缺失檢測，結(jié)果顯示，120例CHD患兒中22q11微缺失10例(8.33%)，涉及的CHD類型多樣，其中室間隔缺損3例，法洛四聯(lián)癥5例，肺動脈狹窄1例，右室雙出口1例。此外，還檢測出1例22q11重復(fù)(0.83%)，其表型為肺動脈狹窄。

表2 MLPA檢測異常者的臨床資料及檢測結(jié)果

22q11.2微缺失在CHD中的比率約為5% ～12%，最常見的表現(xiàn)為室間隔缺損和動脈導(dǎo)管未閉，房間隔缺損也很常見［4，5］，這與本研究結(jié)果 8.33%基本一致。檢測22q11微缺失的方法有很多。最早用染色體核型分析的方法進行診斷，但檢出率較低。熒光原位雜交(FISH)方法既有分子雜交的高度特異性和敏感性，又能在染色體原位顯色，定位準確，結(jié)果穩(wěn)定。但由于DNA探針的高度特異性，不屬于DNA探針范圍之內(nèi)的缺失可能會漏診。此外耗時、昂貴等缺點使FISH檢測在遺傳學(xué)研究和臨床診斷應(yīng)用上受到一定限制。多重 PCR技術(shù)，即利用22q11區(qū)域的微衛(wèi)星標記，進行22q11微缺失檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)82%的病例有不同的微衛(wèi)星位點雜合性缺失［6］。該方法方便，成本低，檢測時間短且比較可靠。但是，該方法必須要有父母的DNA樣品做對照，并且對擴增產(chǎn)物為單一條帶者，難以判別是否存在缺失。有時還必須選取更多的微衛(wèi)星標記，增加成本和工作量。實時熒光定量PCR技術(shù)檢測出22q11微缺失結(jié)果與 FISH的符和率達99.7%［7］。該技術(shù)快速，方便，但不能檢測出染色體的嵌合現(xiàn)象和染色體的平衡易位。

MLPA是2002年由荷蘭的Schouten等設(shè)計發(fā)明的，僅需50～200ng DNA，能在同一反應(yīng)管中對40多個不同的待測核酸靶序列進行定性和半定量分析。其原理是:針對不同的目的基因序列分別設(shè)計一對上下游探針，若待測DNA樣本中含有正常序列，上下游探針則可與其互補結(jié)合并通過鏈接酶鏈接成一條完整的探針，作為模板進行PCR反應(yīng);若目的基因有缺失，兩條探針則不能鏈接，因而形成的模板減少，相應(yīng)終產(chǎn)物的毛細管電泳峰高降低或峰面積減小;反之，目的基因有重復(fù)時則導(dǎo)致毛細管電泳峰高上升或峰面積增大。所以通過終產(chǎn)物電泳峰高或峰面積的變化可判定是否存在基因缺失或重復(fù)，如連續(xù)多個基因發(fā)生缺失或重復(fù)，則可判定為基因片段缺失或重復(fù)［8］。

通過對120例樣本的檢測，筆者體會到高密度探針MLPA檢測染色體微缺失具有多種優(yōu)勢:①能精確定位缺失片段及判定其大小;②對FISH不能檢測的遠端缺失或重復(fù)有較強的檢測能力;③設(shè)立的對照位點多，使結(jié)果更加可靠;④MLPA檢測具有快速、價廉、自動化等特點。然而本方法也存在一些缺陷，由于變性不完全，鹽離子濃度過高導(dǎo)致本研究中有2個樣本需要重復(fù)實驗。延長變性時間使變性更充分;用去離子水洗脫DNA降低離子濃度;對實驗儀器和耗材嚴格消毒等手段可以增加實驗的穩(wěn)定性和成功率。另外發(fā)現(xiàn)，分析數(shù)據(jù)中存在個別染色體基因相對拷貝數(shù)比值低于設(shè)定范圍的現(xiàn)象，可能是受實驗室條件影響，有待進一步分析，以便優(yōu)化實驗條件，確保結(jié)果的真實性。

大多數(shù)學(xué)者認為，凡是 CHD患者均應(yīng)進行22q11微缺失檢測。因為對于患有染色體22q11微缺失的人來說，無論臨床表現(xiàn)有否和輕重如何，都有一半幾率將致病基因遺傳給后代，而且通常也會伴有其他方面的缺陷。因此，如果發(fā)現(xiàn)患兒有22q11微缺失時，應(yīng)對其父母進行同樣檢測，以便為他們生育第二胎提供遺傳咨詢，以有效避免有嚴重綜合征的患兒出生。

目前，國內(nèi)外對22q11微缺失的研究主要著眼于出生以后的人群，而產(chǎn)前診斷方面的報道鮮見。因此，建立22q11微缺失的產(chǎn)前診斷和二級干預(yù)已是當務(wù)之急。MLPA是一種所需樣本少，高通量，相對價廉、快速的檢測方法，具有精確的定位功能，在CHD 22q11微缺失的基因診斷以及產(chǎn)前診斷中具有廣闊的應(yīng)用前景。

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