基于SSR標(biāo)記的茶樹新品種遺傳多樣性分析及指紋圖譜構(gòu)建

章志芳，馬建強(qiáng)

（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所，國(guó)家茶樹改良中心，浙江 杭州 310008）

DNA是生物的基本遺傳物質(zhì)，DNA水平上的遺傳變異是物種差異最直接的體現(xiàn)。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展而形成的DNA分子標(biāo)記技術(shù)，因其多態(tài)性好、易操作和標(biāo)準(zhǔn)化、不受環(huán)境及作物生育期等因素影響等優(yōu)點(diǎn)，已成為作物品種鑒定最有效的檢測(cè)手段。在一系列的分子標(biāo)記體系中，SSR標(biāo)記以其共顯性、操作簡(jiǎn)單、通用性好、重現(xiàn)性高等優(yōu)點(diǎn)，成為最廣泛應(yīng)用的分子標(biāo)記。目前我國(guó)建立的DNA指紋數(shù)據(jù)庫大多采用SSR標(biāo)記體系[1]。

茶樹為多年生木本植物，從幼苗期到成熟投產(chǎn)需要幾年時(shí)間，而在茶樹幼苗期通過表型性狀進(jìn)行品種鑒定十分困難，如若品種混雜，勢(shì)必影響生產(chǎn)效益。因此，開發(fā)高效準(zhǔn)確的品種鑒定方法對(duì)于茶樹新品種保護(hù)、良種推廣等具有重要意義。茶樹SSR標(biāo)記的開發(fā)和應(yīng)用較晚，已發(fā)表的茶樹SSR標(biāo)記約300余個(gè)[2-4]，且多應(yīng)用于遺傳多樣性、遺傳結(jié)構(gòu)等研究[5-6]，而在茶樹DNA指紋圖譜方面的報(bào)道較少[7]。筆者利用SSR標(biāo)記對(duì)14個(gè)茶樹新品種進(jìn)行遺傳多樣性分析和分子鑒定，并嘗試構(gòu)建DNA指紋圖譜，以期為今后開展茶樹分子指紋圖譜庫構(gòu)建、新品種鑒定和評(píng)價(jià)等研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

供試的14個(gè)茶樹樣品（表1）采自中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所“國(guó)家種質(zhì)杭州茶樹圃”，選取完整、無病蟲害感染的一芽二葉新梢，經(jīng)液氮迅速冷凍后保存于-70℃冰箱中備用。

表1 供試的14個(gè)茶樹品種

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA提取 采用改進(jìn)的CTAB法[8]提取基因組DNA，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA質(zhì)量，ND-1000 UV-Vis Spectrophotometer檢測(cè) DNA濃度，稀釋到10 ng/μL用于PCR擴(kuò)增。

1.2.2 EST-SSR標(biāo)記 參照喬婷婷[9]、周炎花[10]報(bào)道的EST-SSR標(biāo)記，挑選其中10個(gè)多態(tài)性較高的標(biāo)記由上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.2.3 PCR擴(kuò)增及產(chǎn)物檢測(cè) 擴(kuò)增反應(yīng)在Bio-Rad PTC-200 PCR儀上進(jìn)行，反應(yīng)體系和擴(kuò)增程序參照喬婷婷[19]的方法。PCR產(chǎn)物用10%的聚丙烯酰胺凝膠在CBS垂直電泳系統(tǒng)上檢測(cè)，電泳后參照Charters和Wilkinson的方法進(jìn)行銀染顯色[11]。

1.2.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析 每個(gè)SSR標(biāo)記只統(tǒng)計(jì)目的片段范圍內(nèi)的一個(gè)等位位點(diǎn)，其中每一條多態(tài)性條帶視為一個(gè)等位變異，將電泳圖上清晰的條帶記為1，同一位置無帶或不易分辨的弱帶記為0。建立0-1原始數(shù)據(jù)庫，然后將相同的帶型組合記為一種基因型；并根據(jù)分子質(zhì)量大小，將等位基因從大到小依次記作 1、2、3等，EST-SSR為共顯性標(biāo)記，對(duì)于二倍體茶樹而言，一條帶表示純合，兩條則為雜合，記錄為 11、22、33、12、13、23 等基因型。

使用POPGENE[12]統(tǒng)計(jì)每個(gè)標(biāo)記在14個(gè)茶樹品種中擴(kuò)增的等位基因數(shù)（Observed number ofalleles，Na），計(jì)算有效等位位點(diǎn)（Effective number of alleles，Ne）、等位基因頻率（Allele frequency），觀測(cè)雜合度（Observed heterozygosity，HO）、期望雜合度（Expected heterozygosity，HE）、Shannon 信息指數(shù)（Shannon’s information index，I）。采用 PowerMarker[13]計(jì)算基因型數(shù)（Genotype）、多態(tài)性信息量（polymorphism information content，PIC）；SSR 位點(diǎn)的多態(tài)性信息量PIC=1-∑Pi2，式中Pi表示第i個(gè)等位位點(diǎn)出現(xiàn)的頻率；并根據(jù)Nei’s遺傳距離[14]構(gòu)建茶樹品種的無根Neighbor-Joining（NJ）聚類圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 14個(gè)茶樹品種的SSR多態(tài)性

10個(gè)EST-SSR標(biāo)記在供試的茶樹品種中均表現(xiàn)出多態(tài)性（表2）。其中PIC>0.5的有3個(gè)，變異范圍在 0.173（TM283）～0.618（TM209），平均為 0.387，表明這些標(biāo)記在參試材料中多態(tài)性適中；10個(gè)標(biāo)記共檢測(cè)到29個(gè)等位基因，等位基因數(shù)變異范圍為2～4個(gè)，平均2.9個(gè)；有效等位基因數(shù)變異范圍為 1.237（TM283）～3.143（TM209），平均 1.993 個(gè)；基因型最多的為 7個(gè)（TM209），最少的為 2個(gè)（TM136，TM283），平均 3.9 個(gè)；遺傳多樣性指數(shù)最高的為 TM209（1.213），最低的為 TM283（0.341）。

表2 10個(gè)茶樹品種SSR標(biāo)記的相關(guān)特征

2.2 茶樹品種SSR標(biāo)記等位基因的出現(xiàn)頻率

29個(gè)等位基因在試驗(yàn)品種中的出現(xiàn)頻率差異很大（表3）。TM283的等位基因2出現(xiàn)頻率最高（89.29%）；其次為TM136的等位基因2（84.62%）和TM131的等位基因1（88.46%）。TM280的等位基因1出現(xiàn)頻率最低（3.57%）；其次為TM131的等位基因2和TM215的等位基因3（均為3.85%）。對(duì)比表2和表3，可見出現(xiàn)頻率較高的等位基因所對(duì)應(yīng)的SSR標(biāo)記其遺傳多樣性指數(shù)都較低。出現(xiàn)頻率較低的等位基因所在的SSR標(biāo)記分為兩類：一類是標(biāo)記的等位基因數(shù)較多的標(biāo)記（TM209，TM211，TM280），另一類是等位基因數(shù)較少的標(biāo)記（TM283）。

表3 SSR標(biāo)記不同等位基因的出現(xiàn)頻率

2.3 14個(gè)茶樹品種的親緣關(guān)系

根據(jù)10個(gè)SSR標(biāo)記等位基因出現(xiàn)頻率計(jì)算Nei’s遺傳距離（D），結(jié)果顯示14個(gè)茶樹品種的遺傳距離在0.036～0.472之間，其中南江1號(hào)和901的遺傳距離最小，表明這兩個(gè)品種間親緣關(guān)系較近，而鄂茶5號(hào)和農(nóng)抗早的遺傳距離最大，說明這兩品種親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。基于Nei’s遺傳距離，采用NJ法構(gòu)建品種聚類圖（圖1）。當(dāng)D=0.12時(shí)，14個(gè)茶樹品種可聚為三類；第一類包括4個(gè)品種，2個(gè)來自湖北（五峰212，五峰310），2個(gè)來自安徽（石佛翠，農(nóng)抗早）；第二類包括2個(gè)安徽品種（901，石佛香）和1個(gè)重慶品種（南江1號(hào)）；第三類包括7個(gè)品種，其中2個(gè)湖北品種（鄂茶5號(hào)，鄂茶6號(hào)），3個(gè)福建品種（茗科3號(hào)，茗科4號(hào)，早玫瑰），1個(gè)四川品種（名山特早芽）和1個(gè)江西品種（大葉龍）。

表4 基于SSR標(biāo)記的14個(gè)茶樹品種的DNA身份證編碼

2.4 14個(gè)茶樹品種的DNA指紋圖譜

將每個(gè)品種經(jīng)不同標(biāo)記擴(kuò)增獲得的等位基因帶型，按照固定標(biāo)記順序排列，串聯(lián)組合成特異的帶型編碼，再轉(zhuǎn)化為計(jì)算機(jī)可識(shí)別的DNA身份證編碼，即該品種的分子指紋圖譜。為了減少編碼序號(hào)長(zhǎng)度，通常在構(gòu)建指紋圖譜時(shí)只選用幾個(gè)鑒別能力較強(qiáng)的標(biāo)記。該研究中只需4個(gè)SSR標(biāo)記（TM128，TM280，TM148，TM211）即可鑒定 14 個(gè)茶樹品種。因此，將這4個(gè)標(biāo)記作為構(gòu)建指紋圖譜的核心標(biāo)記。按照上述標(biāo)記編號(hào)對(duì)每個(gè)茶樹品種的等位基因帶型組合進(jìn)行編碼，獲得13位數(shù)的DNA身份證編碼（表4），依此構(gòu)建14個(gè)茶品種的指紋圖譜（圖1）。結(jié)果顯示，每個(gè)茶樹品種都對(duì)應(yīng)一個(gè)惟一的指紋圖譜，可較為快速地辨別各個(gè)品種。

圖1 基于SSR標(biāo)記的14個(gè)茶樹品種的NJ聚類圖及DNA指紋圖譜

3 討論與結(jié)論

3.1 茶樹品種SSR標(biāo)記等位基因變異

理論上參試品種越多，標(biāo)記檢測(cè)到的等位基因數(shù)就越多。喬婷婷[9]研究表明，其試驗(yàn)選用的10個(gè)SSR標(biāo)記在308份茶樹資源中檢測(cè)到的等位基因數(shù)變異為 3（TM131，TM283）～8（TM211），平均為4.6，PIC只有 TM283小于 0.5，最高為 0.870（TM128），平均為0.677。而在該研究的14個(gè)茶樹品種中檢測(cè)到的等位基因數(shù)變異為2～4個(gè)，平均2.9個(gè)，其中9個(gè)標(biāo)記（除TM131）檢測(cè)到的等位基因數(shù)都少于之前的研究，只有3個(gè)標(biāo)記（TM128，TM209，TM211）PIC 值 大 于 0.5， 最 高 為 0.618（TM209），最低為 0.173（TM283），平均為 0.387。這說明參試材料的不同，可能會(huì)造成標(biāo)記檢測(cè)效率差別較大。因此，在構(gòu)建SSR指紋圖譜庫時(shí)應(yīng)盡可能多地包含核心種植資源，以便獲得更多的特異等位基因。

3.2 茶樹品種SSR標(biāo)記等位基因出現(xiàn)頻率

該研究中等位基因出現(xiàn)頻率變異范圍為3.57%（TM280）～89.29%（TM283）。其中，出現(xiàn)頻率較高的等位基因所在標(biāo)記其遺傳多樣性指數(shù)都較低。而出現(xiàn)頻率較低的等位基因所在的標(biāo)記分為兩類：一類是標(biāo)記的等位基因數(shù)較多（TM209，TM211，TM280），但各等位基因出現(xiàn)頻率較分散，使得其中某一個(gè)等位基因頻率較低；另一類是等位基因數(shù)較少的標(biāo)記（TM283），但其中某一個(gè)等位基因出現(xiàn)頻率極高，而其他等位基因頻率很低。對(duì)于這些在試驗(yàn)材料中出現(xiàn)頻率很低的等位基因，可將其視為特異性等位基因（如TM131等位基因2，TM 209等位基因4，TM215等位基因3，TM280等位基因1），依此便可高效地鑒別具有該特異等位基因的材料，因此也適用于指紋圖譜構(gòu)建。

3.3 14個(gè)茶樹品種的親緣關(guān)系

研究結(jié)果表明，來自不同省份的14個(gè)茶樹品種的Nei’s遺傳距離在0.036～0.472之間，說明這些區(qū)試品種的親緣關(guān)系較近。這可能是由于試驗(yàn)所用的14個(gè)品種均為選育的綠茶適制性品種，在遺傳背景上可能較相近?；谶z傳距離的NJ聚類圖顯示，當(dāng)D=0.12時(shí)，14個(gè)茶樹品種可聚為三類，來源相同的品種基本聚在一起。

3.4 茶樹品種DNA指紋圖譜的構(gòu)建

標(biāo)記的多態(tài)位點(diǎn)數(shù)對(duì)SSR分子標(biāo)記的鑒別力有著重要的正向影響[15]。因此，在構(gòu)建圖譜時(shí)大多選擇多態(tài)性較高的標(biāo)記。該研究中利用4個(gè)SSR標(biāo)記即可將14個(gè)茶樹品種全部分開，并根據(jù)擴(kuò)增的等位基因譜帶組合類型將DNA多態(tài)性信息直接轉(zhuǎn)化為計(jì)算機(jī)化的數(shù)字編碼，然后繪制成可視化的條形碼，結(jié)果顯示每個(gè)品種都有唯一的指紋圖譜，可以快速地對(duì)各品種進(jìn)行鑒定。理論上，在利用SSR標(biāo)記區(qū)分不同品種（二倍體）時(shí)，某一基因型的出現(xiàn)頻率為2/（n+1）n（n為等位基因數(shù)），那么10個(gè)標(biāo)記則可獲得[（n+1）n/2]10個(gè)基因型組合類型。研究中10個(gè)SSR標(biāo)記平均檢測(cè)到2.9個(gè)等位基因，即理論上可區(qū)分3.3×107個(gè)品種。由此可見，利用SSR標(biāo)記構(gòu)建茶樹指紋圖譜進(jìn)行品種鑒定具有極大的潛能和應(yīng)用價(jià)值。隨著茶樹基因組測(cè)序的進(jìn)行，可利用的SSR標(biāo)記將大幅增加，構(gòu)建覆蓋整個(gè)茶樹基因組的茶樹指紋圖譜庫將成為可能，這對(duì)于茶樹新品種的選育、鑒定、保護(hù)等具有重要意義。

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