1個玉米高親和K+轉(zhuǎn)運(yùn)體HKT的生物信息學(xué)分析

陳靚靚，羅為桂，劉 清，蘇 益

（湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南 長沙 410128）

植物 HKT（high-affinity K+transporter）是一類Na+（或K+）轉(zhuǎn)運(yùn)體或Na+-K+共轉(zhuǎn)運(yùn)體的總稱，與植物Na+的吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)及耐鹽關(guān)系密切[1-3]。HKT與微生物的Trk/Ktr同源，它們共同組成了Trk/Ktr/HKT基因家族[4-5]。TaHKT1首先從小麥（Triticum aestivum L.）中分離[6]，隨后在擬南芥（Arabidopsis thaliana L.）、水稻（Oryza sativa L.）等植物中也發(fā)現(xiàn)了 HKT基因[7-8]。HKT由多個跨膜區(qū)和多個孔環(huán)（pore loop，P-loop）組成，基本結(jié)構(gòu)單元是MPM（Transmembrane segment,Pore,Transmembrane segment），植物HKT通常含有4個MPM結(jié)構(gòu)。第1個P-loop中關(guān)鍵的氨基酸位點(diǎn)Gly/Ser影響離子滲透性[9]。HKT家族成員數(shù)量巨大，功能較復(fù)雜，到目前為止，對高等植物HKT的研究主要集中在擬南芥、水稻和小麥等少數(shù)物種中且涉及的成員較少，還未見研究玉米（Zeamay L.）HKT的相關(guān)報(bào)道。該研究利用各種生物信息學(xué)分析工具，將1個玉米中功能還未知的HKT蛋白序列（NP_001168576.1）初步命名為ZmHKT1；5，并分析其蛋白氨基酸序列，推測ZmHKT1；5蛋白的進(jìn)化位置、理化性質(zhì)及分子結(jié)構(gòu)，旨在為進(jìn)一步試驗(yàn)研究ZmHKT1；5轉(zhuǎn)運(yùn)體在玉米中的功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

以GenBank中檢索到的1個玉米中功能還未知的HKT蛋白序列（NP_001168576.1）為檢索序列，使用Blastp程序檢索蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫，篩選獲得同源HKT轉(zhuǎn)運(yùn)體。

1.2 方法

1.2.1 分子進(jìn)化分析 采用ClustalX1.83[10-11]軟件進(jìn)行多重序列比對，將ClustalX比對結(jié)果導(dǎo)入PHYLIP3.69軟件包，用bootstrap程序生成隨機(jī)樣本，隨機(jī)樣本導(dǎo)入prodist程序計(jì)算距離矩陣，neighbor程序?qū)⒕嚯x矩陣轉(zhuǎn)換為N-J多重樹，使用consense程序匯總所得多重樹得到嚴(yán)格一致樹，最后將進(jìn)化樹文件導(dǎo)入MEGA5.05繪制進(jìn)化樹。

1.2.2 蛋白質(zhì)性質(zhì)與結(jié)構(gòu)分析 采用ProtParam（http://web.expasy.org/protparam/）分析蛋白質(zhì)理化性質(zhì)；以BioEdit7.01程序中Hphob./Kyte&Doolittle標(biāo)度進(jìn)行疏水性分析；以SignalP4.0（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）進(jìn)行信號肽預(yù)測；以SOSUI（http://bp.nuap.nagoya-u.ac.jp/sosui/）進(jìn)行跨膜區(qū)域預(yù)測；以 PredictProtein（http://www.predictprotein.org/）進(jìn)行二級結(jié)構(gòu)預(yù)測；以Phyre2（http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/htm l/page.cgi?id=index）進(jìn)行三級結(jié)構(gòu)預(yù)測。

2 結(jié)果與分析

2.1 ZmHKT1；5分子進(jìn)化分析

2.1.1 多重序列比對 根據(jù)第1個P-loop過濾器（filter）上關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)的不同可將植物HKTs分成兩個亞家族[4]。亞類I：第1個P-Loop中關(guān)鍵位點(diǎn)為絲氨酸，通常情況下這類HKT對Na+具有特異選擇性，所有單子葉和雙子葉植物中都含有該類轉(zhuǎn)運(yùn)體[2，12]。亞類II：第1個P-loop中關(guān)鍵位點(diǎn)為甘氨酸，這類轉(zhuǎn)運(yùn)體具有K+-Na+共轉(zhuǎn)運(yùn)特性[8-9]，該亞家族成員只出現(xiàn)在單子葉植物中，但是水稻OsHKT2；1依然為絲氨酸特性[13]。已有研究表明，HKT家族轉(zhuǎn)運(yùn)體在植物耐鹽和調(diào)節(jié)體內(nèi)的Na+/K+平衡中發(fā)揮了重要作用[14-15]。利用ClustalX1.83軟件進(jìn)行多重序列比對，截取HKT類蛋白的4個P-loop區(qū)中高度保守的特征性的氨基酸位點(diǎn)多為甘氨酸（G），ZmHKT1；5蛋白第 1個 P-loop中含有絲氨酸，屬于亞家族I。

2.1.2 蛋白質(zhì)分子進(jìn)化分析 進(jìn)化樹分析及聚類結(jié)果如圖1所示，在HKT蛋白家族中與ZmHKT1；5 關(guān)系較近的轉(zhuǎn)運(yùn)體有 OsHKT1；5、HvHKT1；5、TaHKT1；5等，預(yù)示著在功能上ZmHKT1；5蛋白可能與這些蛋白最為接近，因此將該HKT歸為亞家族I并命名為ZmHKT1；5是合理的。

2.2 ZmHKT1；5性質(zhì)與結(jié)構(gòu)分析預(yù)測

圖1 ZmHKT1;5蛋白及其同源蛋白的進(jìn)化樹分析

2.2.1 理化性質(zhì) ZmHKT1；5蛋白由467個氨基酸殘基組成，分子量為50.88 kD，等電點(diǎn)為9.06。含量較高的氨基酸殘基是Leu（58個）、Ser（47個）、Val（44個）、Ala（39個）、Gly（35個），酸性氨基酸殘基總數(shù)（Asp+Glu）為30，堿性氨基酸殘基總數(shù)（Arg+Lys）為38。蛋白分子中含有9個半胱氨酸，假設(shè)全部形成二硫鍵時(shí)，280 nm處的摩爾消光系數(shù)為 50 920 L/(mol·cm)，0.1% 濃度（1 g/L）的吸光值為1.001。假設(shè)蛋白分子中形成的二硫鍵全部打開，280 nm處的摩爾消光系數(shù)為50 420 L/(mol·cm)，0.1%濃度（1g/L）的吸光值為0.991。成熟蛋白質(zhì)在溶液中的不穩(wěn)定指數(shù)為40.73，高于閾值40，性質(zhì)不穩(wěn)定。脂肪族指數(shù)為98.31，總平均親水性為0.331，疏水性較強(qiáng)。

2.2.2 疏水性分析 根據(jù)BioEdit分析結(jié)果可知，整個ZmHKT1；5蛋白中疏水性最大值約為3.09，最小值約為-2.89，疏水性強(qiáng)的區(qū)域按疏水程度從大到小依次為：360～380、250～265、300～325、390～405、45～65、175～200、145～160、125～135、20～35、280～290、440～450、225～235，這些區(qū)域可能是蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)域（圖2）。

圖2 ZmHKT1；5蛋白疏水性分析

2.2.3 信號肽預(yù)測 使用在線信號肽預(yù)測程序SignalP4.0預(yù)測ZmHKT1；5蛋白N端序列，由圖3可知，各值均未超過閾值，ZmHKT1；5不具信號肽。

圖3 ZmHKT1；5信號肽分析

2.2.4 跨膜區(qū)域預(yù)測 使用在線工具SOSUI分析ZmHKT1；5的膜結(jié)構(gòu)，由表1可知ZmHKT1；5為典型膜蛋白，具有8個跨膜結(jié)構(gòu)。ZmHKT1；5可能的跨膜結(jié)構(gòu)模型如圖4所示。

圖4 ZmHKT1;5蛋白跨膜結(jié)構(gòu)模型

2.2.5 二級結(jié)構(gòu)預(yù)測 PredictProtein的預(yù)測結(jié)果表明，ZmHKT1；5含有58.67% α 螺旋（H）、7.07% β折疊（E）和34.26%無規(guī)卷曲（L）。

2.2.6 三級結(jié)構(gòu)預(yù)測 用Phyre2檢索分析ZmHKT1;5序列，以折疊識別法進(jìn)行三級結(jié)構(gòu)預(yù)測。Phyre2在 PDB（Protein Data Bank）數(shù)據(jù)庫中檢索到編號為c3pjzA的模板（副溶血性弧菌鉀轉(zhuǎn)運(yùn)體TrkH的晶體結(jié)構(gòu)）與目標(biāo)蛋白有很好的同源性，能以100%的信度為目標(biāo)蛋白80%的序列構(gòu)建三級結(jié)構(gòu)。如圖5所示，ZmHKT1；5蛋白的三級結(jié)構(gòu)根據(jù)氨基酸順序著色，順著蛋白N端到C端著色由淺變深，與二級結(jié)構(gòu)預(yù)測及跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果比照，結(jié)果較為統(tǒng)一，所得三級結(jié)構(gòu)預(yù)測較為可信。

圖5 ZmHKT1；5蛋白三級結(jié)構(gòu)預(yù)測

3 討論

通過生物信息學(xué)手段分析了玉米中新型HKT家族蛋白ZmHKT1；5的蛋白序列，確定了該蛋白分類和進(jìn)化位置。ZmHKT1；5具有在氨基酸序列上絲氨酸特性，可能是1個Na+選擇型的轉(zhuǎn)運(yùn)體。從該各項(xiàng)理化性質(zhì)看，ZmHKT1；5具有較強(qiáng)的疏水性。從二級結(jié)構(gòu)上，ZmHKT1；5含大量α螺旋，也含有較多的無規(guī)卷曲，β折疊的含量較少，這種組成與該蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域的形成密切相關(guān)，為該蛋白的離子轉(zhuǎn)運(yùn)功能的實(shí)現(xiàn)提供基本結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。ZmHKT1；5為典型的膜蛋白，具有8個跨膜螺旋，形成4個MPM結(jié)構(gòu)，各個跨膜結(jié)構(gòu)的具體生理功能還有待進(jìn)一步探索。已有研究表明，與ZmHKT1；5親緣關(guān)系很近的OsHKT1；5和TaHKT1；5為Na+選擇型轉(zhuǎn)運(yùn)體，能從根木質(zhì)部卸載Na+，通過控制根木質(zhì)部Na+的移動來調(diào)節(jié)水稻中K+/Na+的比率，維持根中高的K+濃度和低的Na+，在植物耐鹽中起了重要作用[16]。另外，根據(jù)ZmHKT1；5的三維構(gòu)象及其與其他HKT類蛋白高度的同源性可以推測，ZmHKT1；5蛋白可能在玉米的Na+吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)與調(diào)控Na+/K+平衡等方面具有重要作用，其生理功能及其結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系還有待進(jìn)一步深入研究。

[1] Sunarpi,Horie T,Motoda J,et al.Enhanced salt tolerancemediated by AtHKT1 transporter-induced Na+unloading from xylem vessels to xylem parenchyma cells [J].The Plant Journal,2005,44:928-938.

[2] Platten JD,Cotsaftis O,Berthomieu P,et al.Nomenclature for HKT transporters,key determinants of plant salinity tolerance[J].Trends in Plant Science,2006,11（8）:372-374.

[3] Schulze LM,Britto D T,Li M,et al.A pharmacological analysis of high-affinity sodium transport in barley（Hordeum vulgare L.）:a Na+/K+study[J].Journal of Experimental Botany,2012,63（7）:2479-2489.

[4] Corratge F C,Jabnoune M,Zimmermann S,et al.Potassium and sodium transport in non-animal cells:the Trk/Ktr/HKT transporter family [J].Cellular and Molecular Life Sciences,2010,67（15）:2511-2532.

[5] Durell SR,Guy H R.Structural models of the KtrB,TrkH,and Trk1,2 symporters based on the structure of the KcsA K+channel[J].Biophysical Journal,1999,77:789-807.

[6] Schachtman D P,Schroeder J I.Structure and transport mechanism of a high-affinity potassium uptake transporter from higher plants[J].Nature,1994,370:655-658.

[7] Uozumi N,Kim E J,Rubio F,et al.The Arabidopsis HKT1 gene homolog mediates inward Na+currents in Xenopus laevis oocytes and Na+uptake in Saccharomyces cerevisiae[J].Plant Physiology,2000,122（4）:1249-1259.

[8] Horie T,Yoshida K,Nakayama H,et al.Two types of HKT transporters with different properties of Na+and K+transport in Oryza sativa[J].The Plant Journal,2001,27（2）:129-138.

[9] Jabnoune M,Espeout S,Mieulet D,et al.Diversity in expression patterns and functional properties in the rice HKT transporter family[J].Plant Physiology,2009,150（4）:1955-1971.

[10] Larkin M A,Blackshields G,Brown N P,et al.Clustal W and Clustal X version 2.0[J].Bioinformatics,2007，23（21）:2947-2948.

[11] Chenna R,Sugawara H,Koike T,et al.Multiple sequence alignmentwith the Clustal series of programs[J].Nucleic Acids Research,2003,31（13）：3497-3500.

[12] Garciadeblas B,Senn M E,Banuelos M A,et al.Sodium transport and HKT transporters:the ricemodel[J].The Plant Journal,2003,34（6）:788-801.

[13] Horie T,Costa A,Kim T H,et al.Rice OsHKT2;1 transporter mediates large Na+influx component into K+-starved roots for growth[J].The EMBO Journal,2007,26:3003-3014.

[14] Zhang J L,Flowers T J,Wang SM.Mechanisms of sodium uptake by roots of higher plants[J].Plant and Soil,2010,326:45-60.

[15] Haro R,Banuelos M A,Navarro A R.High-affinity sodium uptake in land plants [J].Plant&Cell Physiology.2010,51（1）:68-79.

[16] Ren ZH,Gao JP,Li LG,et al.A rice quantitative trait locus for salt tolerance encodes a sodium transporter[J].Nature Genetics,2005,37:1141-1146.