包素珍 張愛琴 孫在典 宋 紅 李恒楠

（1.浙江中醫(yī)藥大學(xué)，浙江 杭州 310053；2.浙江省腫瘤醫(yī)院，浙江 杭州 310022；3.浙江省中醫(yī)院，浙江 杭州 310006）

現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)黃芪建中湯可減輕放化療后的毒副反應(yīng)，有明顯的抗氧化作用，抑制組織中表皮生長因子及表皮生長因子受體的過度表達進而抑制腫瘤的發(fā)生［1］。cyclin D1為目前公認的癌基因，其過度表達時使細胞周期G1/S期轉(zhuǎn)換時間縮短，導(dǎo)致細胞增殖失控，從而發(fā)生癌變。為進一步明確黃芪建中湯對免疫功能的影響及抑制腫瘤發(fā)生的作用機制，本實驗通過建立脾氣虛Lewis肺癌模型，研究黃芪建中湯對脾氣虛肺癌小鼠免疫功能及cyclin D1基因表達的影響。

1 材料與方法

1.1 動物與瘤株 C57BL/6小鼠60只，雌性，體質(zhì)量（20±2）g，購于上海醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心。飼養(yǎng)于浙江中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心清潔級動物房。小鼠Lewis肺癌瘤株，購于上海醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心。

1.2 藥物 黃芪建中湯由芍藥18 g，桂枝9 g，炙甘草6 g，生姜9 g，大棗4枚，飴糖30 g，黃芪9 g組成。藥材購自浙江中醫(yī)藥大學(xué)門診部中藥房，按《中藥藥理研究方法學(xué)》計算小鼠低、中、高劑量的等效劑量分別為：8.1、16.2、32.4 g/kg體質(zhì)量，分別為成人劑量的6、12、24倍，按常規(guī)方法煎成湯劑，配制成生藥含量分別為 0.324、0.648、1.296 g/mL 的藥液。

1.3 試劑及儀器 D-木糖試劑盒，南京建成生物工程研究所；胃泌素放免試劑盒，北京北方生物技術(shù)研究所；白細胞介素（IL）-2 ELISAKIT試劑盒，上海晶美生物工程有限公司；cyclin D1引物，上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司；TGL-16B臺式高速離心機，上海安亭科學(xué)儀器廠；UV2000紫外分光光度計，美國UNICO公司；2400型PCR儀，英國TECHNE公司產(chǎn)品；GIS-2008凝膠成像系統(tǒng)，上海天能科技有限公司；UR-4100型酶標儀，美國Dynaech公司。

1.4 造模方法 用C57小鼠60只常規(guī)飼養(yǎng)2 d適應(yīng)環(huán)境后，取20只小鼠正常飼養(yǎng)，其余40只小鼠采用苦寒瀉下法造脾氣虛模型（以100 g大黃∶600 mL蒸餾水的比例，于50℃水浴中浸泡8 h，可得大黃浸泡液400 mL。每只小鼠每日灌胃1 mL，連續(xù)9 d。從第5日起，小鼠表現(xiàn)為便溏、納少、倦臥、懶動、消瘦、拱背、精神萎糜等癥狀。第10日分別測正常組和模型對照組各10只小鼠血清木糖濃度及胃泌素水平，驗證脾氣虛模型成功。脾氣虛模型建成后，正常組取10只和模型對照組40只小鼠接種腫瘤：在無菌條件下取接種14 d的新鮮無壞死Lewis癌塊組織，制成單細胞懸液，0.9%氯化鈉注射液調(diào)整濃度至6×106個/mL，取0.2 mL癌細胞原液，接種于小鼠的左腋下皮下。從取出腫瘤到移植完最后1只小鼠時間控制在2 h之內(nèi)。

1.5 分組與給藥 C57BL小鼠接種24 h后，隨機分為6組，每組10只。正常組、腫瘤對照組、模型對照組給以灌胃0.9%氯化鈉注射液0.5 mL，每日1次，黃芪建中湯低、中、高劑量組分別給以低、中、高的黃芪建中湯0.5 mL灌胃，每日1次。連續(xù)14 d。

1.6 標本采集與檢測 觀察小鼠的體質(zhì)量、飲食、行動、精神食欲、行動狀態(tài)、毛色、皮毛的光澤度等全身情況。給藥結(jié)束后第2日稱體質(zhì)量，眼球后取血，檢測血清木糖濃度及血清胃泌素水平；脫頸椎處死小鼠，無菌剝?nèi)×鰤K，保存于液氮中，RT-PCR法檢測cyclin D1的表達。

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計軟件。計量資料用（±s）表示，計量資料兩組間比較用t檢驗，多組間比較用one-way方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 脾氣虛Lewis肺癌小鼠模型建立 見表1。從建立脾氣虛模型第5日起，小鼠表現(xiàn)為便溏、納少、倦臥、懶動、消瘦、拱背、精神萎靡等癥狀。造模第10日球后取血，檢測血清木糖濃度及胃泌素含量均低于正常，與正常組比較，差異非常顯著 （P＜0.01）（見表1）。同時在小鼠左腋下接種Lewis肺癌瘤株，小鼠于接種后第7～10日腋下出現(xiàn)大小不等的腫塊，以模型對照組較明顯；第15日處死小鼠，取血檢測血清木糖濃度及胃泌素水平驗證脾氣虛模型仍存在，提示小鼠脾氣虛Lewis肺癌模型復(fù)制成功。

表1 不同組別小鼠血清血清木糖、胃泌素水平比較（±s）

表1 不同組別小鼠血清血清木糖、胃泌素水平比較（±s）

與正常組比較，**P＜0.01。

組 別 n 血清木糖（mmol/L） 血清胃泌素（pg/mL）正常組 10 3.21±0.32 33.56±3.51模型對照組 10 2.09±0.24** 27.14±0.19**

2.2 各組小鼠瘤質(zhì)量及抑瘤率比較 見表2。實驗結(jié)果顯示黃芪建中湯各劑量組瘤質(zhì)量均減輕，與模型對照組比較，差異顯著（P＜0.05），以高劑量組抑瘤效果最佳（P＜0.01）。

2.3 各組小鼠脾指數(shù)和胸腺指數(shù)比較 見表3。本實驗結(jié)果顯示：黃芪建中湯中、高劑量組脾指數(shù)、胸腺指數(shù)增加顯著，與模型對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05或0.01）。

表2 各組小鼠瘤質(zhì)量及抑瘤率比較（±s）

表2 各組小鼠瘤質(zhì)量及抑瘤率比較（±s）

與模型對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。下同。

組 別 n 瘤質(zhì)量（g） 抑瘤率（%）腫瘤對照組 10 3.72±0.47 -模型對照組 10 3.82±0.83 -黃芪建中湯低劑量組 10 3.32±0.46* 13.09黃芪建中湯中劑量組 10 2.98±0.24* 21.99黃芪建中湯高劑量組 10 2.34±0.34** 38.74

表2 各組小鼠脾指數(shù)及胸腺指數(shù)比較（±s）

表2 各組小鼠脾指數(shù)及胸腺指數(shù)比較（±s）

組 別 n 脾指數(shù)（mg/g） 胸腺指數(shù)（mg/g）正常組 10 18.14±1.38 2.89±0.35腫瘤對照組 10 13.24±1.94 1.96±0.70模型對照組 10 12.31±0.79 1.75±0.45黃芪建中湯低劑量組 10 14.50±3.16 2.01±0.29黃芪建中湯中劑量組 10 15.31±2.59* 2.32±0.53*黃芪建中湯高劑量組 10 17.28±2.85** 2.54±0.60**

2.4 各組小鼠腫瘤組織中cyclin D1-mRNA/GAPDH的基因表達比較 見表4，圖1。黃芪建中湯中、高劑量組cyclin D1-mRNA/GAPDH表達下降，以高劑量組最為顯著，與模型對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。

表4 各組小鼠腫瘤組織cyclin D1-mRNA/GAPDH表達比較（±s）

表4 各組小鼠腫瘤組織cyclin D1-mRNA/GAPDH表達比較（±s）

組 別 n cyclin D1/GAPDH腫瘤對照組 10 0.73±0.09模型對照組 10 0.96±0.15黃芪建中湯低劑量組 10 0.95±0.24黃芪建中湯中劑量組 10 0.66±0.17黃芪建中湯高劑量組 10 0.62±0.11**

圖1 各組cyclin D1基因、GAPDH基因表達

3 討 論

cyclin D1是G1期細胞周期素，主要作用是促進細胞通過G1/S檢查點，cyclin D1對細胞周期G1期的調(diào)控是通過對抑癌基因蛋白pRb的調(diào)控實現(xiàn)的。pRb通過信號傳遞促進cyclin D1基因表達［2］。G1/S調(diào)控點是細胞周期中最重要的調(diào)控點，決定細胞周期的時間。cyclin D1過度表達是導(dǎo)致G1/S期檢測點缺陷主要原因。檢測點功能缺陷可能會導(dǎo)致遺傳基因突變和染色體結(jié)構(gòu)異常的細胞獲得增殖，從而導(dǎo)致腫瘤發(fā)生［3］。腫瘤是一種細胞周期性疾病，cyclin D1作為細胞周期重要的正調(diào)控因子在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中起著重要的作用［4-6］。

中醫(yī)學(xué)認為“脾為后天之本，氣血生化之源”，有防御外邪侵害并自我恢復(fù)的作用?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)證明，其和機體免疫功能有著密切的聯(lián)系。如李艷等［7］對ConA、LPS誘導(dǎo)T、B淋巴增殖反應(yīng)，可使大黃煎液建立的脾虛小鼠不同程度地提高其體液免疫功能。杜雅薇等［8］研究發(fā)現(xiàn)中藥組可不同程度提高大黃致脾虛泄瀉的SIgA、IL-2。而IL-2是最主要、最強有力的T細胞生長因子，并且可誘導(dǎo)或促進多種細胞毒細胞活性，如自然殺傷細胞（NK）、細胞毒性T淋巴細胞（CTL）、淋巴因子激活的殺傷細胞（LAK）細胞，這些細胞在機體的免疫監(jiān)視免疫方面至關(guān)重要。王紅偉等［9］發(fā)現(xiàn)脾虛機體的紅細胞C3b-受體花環(huán)率（C3b-RR）和T淋巴細胞轉(zhuǎn)化率明顯降低，而Ic-RR明顯升高，提示紅細胞介導(dǎo)的消除循環(huán)免疫復(fù)合物及免疫黏附功能下降，從而導(dǎo)致脾虛時免疫功能的低下，淋巴細胞亞群比例的失調(diào)，這在脾虛型惡性腫瘤患者中的表現(xiàn)較為明顯。

肺癌病位在肺，病機為陰陽不和，病本為正氣不足。癌著于身，易走竄耗傷氣血所致惡病質(zhì)居多。在中醫(yī)范圍內(nèi)又屬虛勞范疇。黃芪建中湯出自《金匱要略·血痹虛勞》“虛勞里急，諸不足，黃芪建中湯主之”，藥用黃芪、桂枝、芍藥、炙甘草、生姜、大棗、飴糖組成，功能在于燮理陰陽，培補脾氣，使谷氣充足，正氣旺盛。本實驗提示黃芪建中湯組均有升高脾指數(shù)、胸腺指數(shù)的作用，并降低cyclin D1/GAPDH水平。黃芪建中湯抑制腫瘤的機理之一可能是改善脾氣虛肺癌小鼠的免疫功能、下調(diào)腫瘤組織cyclin D1-mRNA的表達。

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