何文強(qiáng)，尹繼云，孟 曉，王梅葉，張文濤，曲憲東，李南南

武警河南總隊(duì)醫(yī)院泌尿外科鄭州450052

膀胱癌是泌尿系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一［1-2］，目前主要采用手術(shù)、放療和化療等手段治療，但是治療后極易復(fù)發(fā)和進(jìn)展，預(yù)后較差。近年來分子靶向治療作為綜合治療的一個(gè)重要手段和新興治療模式在臨床中受到越來越多的關(guān)注，因此尋找治療膀胱癌的分子靶點(diǎn)具有十分重要的意義。Pim-3激酶是前病毒整合位點(diǎn)莫羅尼鼠白血病病毒家族的成員之一，屬于鈣/鈣調(diào)蛋白依賴性激酶成員，具有絲氨酸/蘇氨酸激酶活性［3］。作者利用RNA干擾技術(shù)下調(diào)膀胱癌T24細(xì)胞中Pim-3的表達(dá)，研究其對膀胱癌細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期分布的影響，并分析其可能的分子機(jī)制，旨在為以Pim-3為靶點(diǎn)的膀胱癌基因治療提供新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞與試劑 膀胱癌T24細(xì)胞購自上海川翔生物科技有限公司;胰蛋白酶和RPMI 1640購自美國Gibco公司、小牛血清購自杭州四季青生物工程材料有限公司;脂質(zhì)體LipofectaminTM2000購自美國Invitrogen公司;CCK-8購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司;Pim-3小干擾RNA(small interfering RNA，siRNA)、對照siRNA、兔抗人多克隆抗體Pim-3、Cyclin D1、Cdk2和P21均購自美國Santa Cruz公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染 將膀胱癌T24細(xì)胞復(fù)蘇后培養(yǎng)于含體積分?jǐn)?shù)10%小牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基中，細(xì)胞分為3組:未處理組(不作任何處理)、對照siRNA組(采用50 nmol/L對照siRNA轉(zhuǎn)染)和Pim-3 siRNA組(利用50 nmol/L Pim-3 siRNA轉(zhuǎn)染)。當(dāng)T24細(xì)胞達(dá)到90%左右融合時(shí)，按照脂質(zhì)體LipofectaminTM2000轉(zhuǎn)染試劑操作說明將Pim-3 siRNA和對照siRNA轉(zhuǎn)入T24細(xì)胞。

1.3 Western blot檢測 Pim-3、CyclinD1、Cdk2 和P21蛋白表達(dá) 收集轉(zhuǎn)染后48 h的膀胱癌T24細(xì)胞，用細(xì)胞裂解液提取總蛋白，然后進(jìn)行SDS-PAGE電泳。電泳結(jié)束后，取下凝膠電轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上。用含50 g/L脫脂奶粉的TBST液封閉NC膜2 h，加入 Pim-3、Cyclin D1、Cdk2、P21 和 β-actin 一抗(均稀釋200倍)，4℃搖床過夜孵育。第2天加入二抗室溫孵育2 h。將NC膜置于增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光試劑ECL中反應(yīng)1～3 min，于暗室中利用X射線曝光，常規(guī)方法顯影定影，顯示特異的蛋白信號。蛋白表達(dá)的灰度值利用Image-Pro Plus 5.0軟件分析，以目的基因與內(nèi)參β-actin基因灰度值的比值表示蛋白相對表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4 細(xì)胞增殖速率檢測 分別收集轉(zhuǎn)染后的24、48、72和96 h的膀胱癌T24細(xì)胞，當(dāng)測定增殖速率時(shí)，加入終濃度為體積分?jǐn)?shù)10%的CCK-8試劑，于37℃ CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育3 h后于酶標(biāo)儀上測定450 nm的吸光度。

1.5 細(xì)胞周期檢測 收集轉(zhuǎn)染后48 h的膀胱癌T24細(xì)胞約1×106個(gè)。利用PBS緩沖液漂洗細(xì)胞，并置于4℃、體積分?jǐn)?shù)70%的冰乙醇中固定30 min，采用冷PBS漂洗3次，然后將細(xì)胞重懸于含40 μg碘化丙啶和100 μg RNase A的PBS溶液中，于37℃孵育30 min。最后采用流式細(xì)胞儀檢測樣品中G0/G1、S和G2/M期細(xì)胞數(shù)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 13.0分析，3組膀胱癌 T24 細(xì)胞中 Pim-3、Cyclin D1、Cdk2、P21 蛋白的表達(dá)，細(xì)胞增殖速率和細(xì)胞分布周期的比較采用單因素方差分析和SNK-q檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 3組膀胱癌 T24細(xì)胞中 Pim-3、Cyclin D1、Cdk2、P21蛋白的表達(dá) 見圖1、表1。

圖1 3組膀胱癌T24細(xì)胞中Pim-3、Cyclin D1、Cdk2、P21 蛋白的表達(dá)

表1 3組膀胱癌T24細(xì)胞中Pim-3、Cyclin D1、Cdk2、P21 蛋白的表達(dá)(n=3)

2.2 3組膀胱癌T24細(xì)胞的增殖速率 見表2。

表2 3組膀胱癌T24細(xì)胞的增殖速率(n=5)

2.3 3組膀胱癌T24細(xì)胞周期分布 見表3。

表3 3組膀胱癌T24細(xì)胞周期分布(n=3)%

3 討論

研究［4-8］表明，原癌基因 Pim-3在腫瘤中的過表達(dá)與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。Pim-3在胃癌組織中的表達(dá)明顯高于正常胃黏膜組織，且與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和靜脈轉(zhuǎn)移密切相關(guān)［9］。Pim-3 mRNA和蛋白在所有的胰腺癌細(xì)胞系中都有表達(dá)，并且和前凋亡蛋白Bad共同發(fā)揮作用［6］。以上研究提示Pim-3的高表達(dá)在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中可能發(fā)揮重要作用，進(jìn)一步阻斷Pim-3可能成為腫瘤分子靶向治療的一個(gè)十分重要的靶點(diǎn)。該研究結(jié)果顯示，Pim-3 siRNA轉(zhuǎn)染后48 h顯著下調(diào)了T24細(xì)胞中Pim-3蛋白的表達(dá)，為后續(xù)進(jìn)一步研究Pim-3的功能提供理論依據(jù)。

目前，許多研究［7，10-11］表明，Pim-3 shRNA 處理后在體外通過增加不同類型的腫瘤細(xì)胞(包括結(jié)腸癌、肝癌和胰腺癌)的凋亡而抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。與野生型的小鼠相比，采用二乙基亞硝氨(一種潛在的肝癌誘導(dǎo)劑)處理Pim-3的轉(zhuǎn)基因小鼠，在早期能加速肝細(xì)胞的增殖［5］。此外，所有的Pim激酶家族成員均能結(jié)合蘇氨酸殘基處磷酸化Cdk抑制因子P27，誘導(dǎo)P27與14-3-3蛋白結(jié)合，導(dǎo)致細(xì)胞周期分布發(fā)生改變［12］。這些研究表明，Pim-3在腫瘤細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期進(jìn)程中發(fā)揮重要作用。該研究結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染 Pim-3 siRNA后的48～96 h，膀胱癌T24細(xì)胞的增殖受到明顯的抑制。進(jìn)一步流式細(xì)胞結(jié)果顯示，Pim-3表達(dá)下調(diào)能明顯誘導(dǎo)T24細(xì)胞周期靜止在G0/G1期，并降低S期細(xì)胞的比率，從而阻斷DNA的合成，進(jìn)一步抑制細(xì)胞的增殖。因?yàn)榧?xì)胞增殖抑制和細(xì)胞周期分布改變與細(xì)胞周期調(diào)控蛋白表達(dá)的變化密切相關(guān)，所以作者利用Western blot檢測與細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期密切相關(guān)的Cyclin D1、Cdk2和P21蛋白的表達(dá)，結(jié)果表明，Pim-3表達(dá)下調(diào)能明顯下調(diào)Cyclin D1和Cdk2蛋白的表達(dá)，但上調(diào)P21蛋白的表達(dá)，提示Pim-3表達(dá)下調(diào)介導(dǎo)的增殖抑制和細(xì)胞周期靜止可能與上述細(xì)胞周期調(diào)控蛋白表達(dá)的變化密切相關(guān)，但是其詳細(xì)的分子機(jī)制尚需要進(jìn)一步探討。

綜上所述，Pim-3 siRNA能有效下調(diào)膀胱癌細(xì)胞中Pim-3蛋白的表達(dá)，其表達(dá)下調(diào)明顯抑制細(xì)胞增殖和改變細(xì)胞周期的分布，可能與細(xì)胞周期調(diào)控蛋白表達(dá)的變化密切相關(guān)，進(jìn)一步研究膀胱癌中Pim-3的功能有望為以Pim-3為靶點(diǎn)的膀胱癌基因治療提供新的理論依據(jù)。

［1］Ploeg M，Aben KK，Kiemeney LA.The present and future burden of urinary bladder cancer in the world［J］.World J Urol，2009，27(3):289

［2］Parkin DM.The global burden of urinary bladder cancer［J］.Scand J Urol Nephrol Suppl，2008(218):12

［3］Mukaida N，Wang YY，Li YY.Roles of Pim-3，a novel survival kinase，in tumorigenesis［J］.Cancer Sci，2011，102(8):1437

［4］Yang XY，Ren CP，Wang L，et al.Identification of differentially expressed genes in metastatic and non-metastatic nasopharyngeal carcinoma cells by suppression subtractive hybridization［J］.Cell Oncol，2005，27(4):215

［5］Wu Y，Wang YY，Nakamoto Y，et al.Accelerated hepatocellular carcinoma development in mice expressing the Pim-3 transgene selectively in the liver［J］.Oncogene，2010，29(15):2228

［6］Li YY，Wu Y，Tsuneyama K，et al.Essential contribution of Ets-1 to constitutive Pim-3 expression in human pancreatic cancer cells［J］.Cancer Sci，2009，100(3):396

［7］Popivanova BK，Li YY，Zheng H，et al.Proto-oncogene，Pim-3 with serine/threonine kinase activity，is aberrantly expressed in human colon cancer cells and can prevent Bad-mediated apoptosis［J］.Cancer Sci，2007，98(3):321

［8］Zheng HC，Tsuneyama K，Takahashi H，et al.Aberrant Pim-3 expression is involved in gastric adenoma-adenocarcinoma sequence and cancer progression［J］.J Cancer Res Clin Oncol，2008，134(4):481

［9］胡志方，黃緣，鐘瓊，等.Pim-3異常表達(dá)在胃癌中的意義［J］.世界華人消化雜志，2008，16(31):3515

［10］Fujii C，Nakamoto Y，Lu P，et al.Aberrant expression of serine/threonine kinase Pim-3 in hepatocellular carcinoma development and its role in the proliferation of human hepatoma cell lines［J］.Int J Cancer，2005，114(2):209

［11］Li YY，Popivanova BK，Nagai Y，et al.Pim-3，a protooncogene with serine/threonine kinase activity，is aberrantly expressed in human pancreatic cancer and phosphorylates bad to block bad-mediated apoptosis in human pancreatic cancer cell lines［J］.Cancer Res，2006，66(13):6741

［12］Morishita D，Katayama R，Sekimizu K，et al.Pim kinases promote cell cycle progression by phosphorylating and down-regulating p27Kip1 at the transcriptional and posttranscriptional levels［J］.Cancer Res，2008，68(13):5076