武治印，胡勁松

1)中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所北京100094 2)國家開發(fā)銀行北京100037

A型H1N1流感病毒2009年血凝素蛋白變異分析*

武治印1)，胡勁松2)#

1)中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所北京100094 2)國家開發(fā)銀行北京100037

#通訊作者，男，1979年7月生，博士，高級工程師，研究方向:細(xì)胞生物學(xué)，E-mail:jingsonghu@126.com

流感病毒;血凝素蛋白;變異

目的:通過分析血凝素蛋白的演變規(guī)律探討A型H1N1流感病毒的進(jìn)化來源及流行特點。方法:利用生物信息學(xué)方法，比較A/Mexico/4108/2009(H1N1)毒株和與其相關(guān)的22株流感病毒血凝素蛋白序列的進(jìn)化關(guān)系，重點分析A/Mexico/4108/2009(H1N1)毒株相關(guān)氨基酸位點的變異情況。結(jié)果:A/Mexico/4108/2009(H1N1)血凝素蛋白的蛋白酶剪切位點、受體結(jié)合位點以及表面抗原位點都與1918年和1976年暴發(fā)的H1N1流感病毒類似，可能涉及H1N1流感病毒在不同宿主間的傳播、重組。結(jié)論:A/Mexico/4108/2009(H1N1)毒株的病毒毒力、感染性以及免疫原性發(fā)生了一定的變異，并且可能在變異過程中發(fā)生了向1918年和1976年的H1N1流感病毒的回復(fù)突變。

2009年蔓延全球的A型H1N1流感疫情是近年來影響范圍較廣、社會關(guān)注度較高的疫情。現(xiàn)在再次審視疫情暴發(fā)的特點和規(guī)律，對于進(jìn)一步做好今后的傳染病防控?zé)o疑具有重大的現(xiàn)實意義。根據(jù)核蛋白和基質(zhì)蛋白抗原性的不同，流感病毒分為A、B和C 3型。A型流感病毒變異較快，B、C型變異較慢。世界范圍內(nèi)幾次流感大流行均由A型病毒引起，為防治流感帶來極大的挑戰(zhàn)［1］。血凝素蛋白是流感病毒最主要的抗原，其抗體能中和流感病毒［2］。血凝素蛋白前體蛋白(562～566氨基酸)經(jīng)細(xì)胞內(nèi)源性蛋白酶剪切成2條以二硫鍵相連的蛋白:血凝素蛋白1(319～326氨基酸)和血凝素蛋白2(221～222氨基酸)。其中，血凝素蛋白1位于囊膜外部，負(fù)責(zé)與受體的結(jié)合，包含5個主要的抗原位點;血凝素蛋白2區(qū)包括小部分胞外區(qū)及C末端的跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)，將血凝素蛋白分子嵌在膜上;血凝素蛋白2區(qū) N端的10個氨基酸構(gòu)成疏水性融合肽，在膜融合過程中起重要作用［3］。在流感病毒感染過程中，血凝素蛋白通過和唾液酸受體結(jié)合，完成病毒對細(xì)胞的吸附，并能介導(dǎo)病毒囊膜和酸性內(nèi)吞泡膜的融合［4］。血凝素蛋白的5個抗原位點(Sa、Sb、Ca1、Ca2和Cb)位于蛋白頭部，不同亞型的血凝素蛋白抗原表位氨基酸位點有所不同［5-6］。流感病毒RNA片段重排會導(dǎo)致其抗原性不斷發(fā)生變異［7］，進(jìn)而影響血凝素蛋白與受體結(jié)合位點的變化［8］。該研究主要利用生物信息學(xué)方法，比較分析2009年暴發(fā)的流感病毒A/Mexico/2009(H1N1)株與已知的流感病毒毒株血凝素蛋白進(jìn)化關(guān)系和氨基酸位點變異等情況，分析A/Mexico/2009(H1N1)株的進(jìn)化來源和進(jìn)化特征。

1 材料與方法

1.1 血凝素蛋白序列 用于分析的血凝素蛋白序列來源于NCBI。根據(jù)蛋白序列初步比較分析，選擇包括A/Mexico/4108/2009(H1N1)毒株在內(nèi)的23條具有代表性的流感病毒血凝素蛋白序列(表1)。

表1 23株流感病毒毒株信息

1.2 序列分析方法 用于序列分析的其他參考病毒序列分析方法包括:①NCBI提供的在線BLASTp程序。②多序列比對，使用的軟件為ClustalX Multiple Sequence Alignment Program 1.83，比對結(jié)果使用weblogo程序的在線服務(wù)器。③基于多序列比對的結(jié)果繪制進(jìn)化樹，使用的軟件為MEGA 5。

2 結(jié)果

2.1 A/Mexico/2009(H1N1)毒株血凝素蛋白BLASTp分析 A/Mexico/2009(H1N1)血凝素蛋白序列與2009年世界其他地方分離得到的人感染A型H1N1病毒高度相似(一致性＞99%);與2009年分離得到的豬感染的A/swine/Alberta/2009(H1N1)毒株血凝素蛋白序列高度相似(一致性＞98%);并且與 A/Iowa/CEID23/2005(H1N1)、A/New Jersey/1976(H1N1)、A/swine/Iowa/1988(H1N1)等毒株血凝素蛋白序列相似度較高(表2)。

2.2 A/Mexico/2009(H1N1)毒株血凝素蛋白進(jìn)化樹分析 結(jié)果見圖1。可見A/Mexico/2009(H1N1)與A/Iowa/2005(H1N1)親緣關(guān)系最近。這2株人源流感病毒與豬源流感病毒A/swine/Iowa/1988(H1N1)、A/swine/Wisconsin/1961(H1N1)、A/swine/Ratchaburi/2000(H1N1)、A/swine/Chachoengsao/2005(H1N1)進(jìn)化上同屬一個分支。同時，A/Mexico/2009(H1N1)與人源 A/South Carolina/1918(H1N1)、A/New Jersey/1976(H1N1)進(jìn)化關(guān)系較近，而與自1918年以來小規(guī)模流行的其他人源流感病毒的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。從跨亞型來看，A/Mexico/2009(H1N1)與 A/Hong Kong/97(H5N1)和 A/Japan/1957(H2N2)進(jìn)化關(guān)系較近，而與 A/Hong Kong/1968(H3N2)較遠(yuǎn)。

表2 A/Mexico/4108/2009(H1N1)血凝素蛋白序列相似度比較

圖1 23株流感病毒血凝素蛋白進(jìn)化樹

2.3 A/Mexico/2009(H1N1)毒株血凝素蛋白序列變異分析

2.3.1 蛋白酶水解位點 包括 A/Mexico/2009(H1N1)在內(nèi)的23株H1N1流感病毒的血凝素蛋白酶水解位點(344～345氨基酸殘基位點)變異很小，十分保守，水解位點附近的氨基酸序列變異也很小(圖2)。

圖2 23株H1N1流感病毒血凝素蛋白水解位點氨基酸比對結(jié)果的logo圖

2.3.2 受體結(jié)合位點 結(jié)果見表3。可見190螺旋氨基酸變化不大，而220環(huán)和130環(huán)氨基酸變異較大。其中130環(huán)氨基酸序列在大流行流感病毒株相同，而在小流行流感病毒中變化較大，且氨基酸種類和極性均有所變化。220環(huán)氨基酸序列變異較大，221位(S)、223 位(Y)、227 位(F)未發(fā)生變異;225位和226位發(fā)生R與K的替換，其氨基酸種類和極性未發(fā)生變化;224位氨基酸變異帶有進(jìn)化順序的關(guān)系，由1976年以前的N變異為1976年以后的S;222位和228位的氨基酸呈現(xiàn)出變異的多樣化。

表3 H1N1流感病毒血凝素蛋白受體結(jié)合位點比較

2.3.3 糖基化位點 27位、28位、40位、104位、304位和498位糖基化位點并未發(fā)生變異，也未缺失。但是這些糖基化位點附近氨基酸殘基發(fā)生變異，有些氨基酸的種類和極性還有所變化，如305位發(fā)生S→T變異。

2.3.4 二硫鍵位點 二硫鍵位點(［21，481］、［59，292］、［72，84］、［107，153］、［296，320］、［488，492］)未發(fā)生變異。但是，在這些二硫鍵附近的氨基酸發(fā)生了變異，如491位存在A與T的替換，氨基酸種類和極性都發(fā)生變化。

2.3.5 表面抗原位點 結(jié)果見表4?？梢?Sa區(qū)128(F)、129(E)、160(S)、162(Y)、165(L)、167(W)，Sb區(qū)192(V)、198(H)，Ca2 區(qū) 140(W)、143(H)，Cb 區(qū)79(L)、81(N)、82(P)、83(E)、122(L)等氨基酸位點未發(fā)生變異。

A/South Carolina/1/1918、A/New Jersey/1976 2株流感病毒與A/Mexico/2009比較來看，163位R→R→K、166 位 L→I→I、196 位 V→I→I、173 位 S→N→N、145位 T→T→S、225位 R→R→K、78 位 L→L→I。這些位點氨基酸雖發(fā)生變異，但是發(fā)生變異后氨基酸的種類和極性均未發(fā)生改變。而159位S→N→K、169位 T→V→V、144位E→E→D、224位N→N→S，這些位點發(fā)生變異后，其氨基酸種類和極性發(fā)生了較大改變。

A/Mexico/2009與 A/Iowa/2005毒株相比，對于163位 R→K、145位 T→S，A/Iowa/2005與以前的H1N1流感病毒相同，這些位點在2009年毒株中發(fā)生變異，但是氨基酸種類和極性未發(fā)生變化。對于193位 I→L、207位 T→S，A/Mexico/2009與前幾次大流行的病毒相同。對于159位N→K，1918年和1934年、1976年和2005年此位點氨基酸相同，而2009年與上述年份毒株均不同，但與豬和禽類的相同，此位點變異具有較大的多樣性，且A/Mexico/2009毒株血凝素蛋白與豬和禽來源的毒株有較強(qiáng)的親緣關(guān)系。

A/Mexico/2009與A/Puerto Rico/34序列比較，2株病毒血凝素蛋白表面抗原位點氨基酸變異較多。

表4 H1N1流感病毒血凝素蛋白表面抗原位點比較

3 討論

3.1 A/Mexico/2009流行毒株可能是流感病毒在不同宿主間傳播并重組的結(jié)果 A/Mexico/2009血凝素蛋白很可能是流感病毒在不同物種間傳播和重組的結(jié)果。序列比對和進(jìn)化樹分析結(jié)果顯示，A/Mexico/2009血凝素蛋白來源明顯與近期大多數(shù)小規(guī)模流行的人源流感病毒不同。A/Mexico/2009血凝素蛋白可能來源于2000年至2005年豬源流感病毒，并可追溯至1935年、1942年和1988年豬源流感病毒以及1918年和1976年大流行的人源流感病毒。

物種間的傳播和變異可能是病毒引起感染和致病性變化最大的因素。流感病毒宿主范圍十分廣泛，其RNA片段重組會引起流感病毒抗原性的巨大改變，這往往是引起新一輪流感流行的原因［9］。來源于豬體內(nèi)的H1抗原于1918年暴發(fā)，并在歐洲引起數(shù)千萬人的死亡。1957年、1968年、1976年流行的H1N1病毒毒株都曾發(fā)生重組事件。雖然A/H1流感病毒在2009年之前未再大規(guī)模流行，但是1918年和1976年A/H1流感病毒的基因片段在禽類和豬流感病毒中屢有發(fā)現(xiàn)。作者的進(jìn)化樹分析結(jié)果也清晰地反映了這點。而在上述流感大流行期間和之后，在人群中小規(guī)模流行的A型流感病毒的感染性和病毒毒力遠(yuǎn)不如上述A型流感病毒，進(jìn)化分析結(jié)果也表明這些流感病毒與豬和禽類流感病毒的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

豬可能是流感病毒跨物種傳播的中間宿主。血凝素蛋白識別受體是宿主細(xì)胞表面的唾液酸分子。在禽類中，唾液酸是以α-2，3的方式結(jié)合在糖鏈上的，而在人類中，唾液酸是以α-2，6的方式結(jié)合的。因此，流感病毒在人與禽類間無法直接傳播。但是，流感病毒可以通過某些中間宿主，例如豬，來完成受體結(jié)合方式的變異。這是因為豬體內(nèi)，既存在α-2，3唾液酸，又存在α-2，6唾液酸，因此能夠同時被禽流感病毒和人流感病毒感染，為流感病毒變異提供了最佳場所［10］。

3.2 A/Mexico/2009血凝素蛋白分子特征 血凝素蛋白剪切位點的序列特征與毒株毒力有關(guān)。近年來，世界各地出現(xiàn)了高致病性H5N1禽流感，并偶然感染人類。而2009年暴發(fā)的H1N1流感與禽類流感病毒親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，且其表現(xiàn)出高傳染性但致死率卻不高的特點。與流感病毒毒性相關(guān)的分子水平特征之一就是血凝素蛋白的蛋白酶剪切位點的連續(xù)堿性氨基酸。A/Mexico/2009的血凝素蛋白剪切位點的序列特征與1918年和1976年暴發(fā)的H1N1流感病毒比較接近，其序列為 PSIQSRGLFGAIAG FIEGGWTGM。與H5N1亞型相比，H1N1亞型剪切位點附近氨基酸多為脂肪族氨基酸，堿性氨基酸較少，這往往會影響病毒毒力。因此，H1N1亞型流感病毒的毒力相對H5、H7等其他亞型而言較弱。1918年暴發(fā)的H1N1亞型流感導(dǎo)致約2 000萬人死亡，主要原因一是病毒自身毒力較強(qiáng)，二是由于當(dāng)時缺乏抗生素，很多患者因繼發(fā)的細(xì)菌感染而死亡。同時，流感病毒的毒力還與神經(jīng)氨酸酶、聚合酶等蛋白相關(guān)。

A/Mexico/2009與其他H1亞型的血凝素蛋白相似度較高，三維結(jié)構(gòu)可能沒有明顯的變化。但是，從蛋白二維結(jié)構(gòu)來看，雖然A/Mexico/2009血凝素蛋白的二硫鍵位點發(fā)生變異或缺失，但是這些位點附近的氨基酸發(fā)生部分變異，有的氨基酸種類和極性均發(fā)生改變，會在一定程度上影響 A/Mexico/2009血凝素蛋白的三維空間構(gòu)象。雖然這種影響并非一種質(zhì)變，但也會影響A/Mexico/2009血凝素蛋白感染性和免疫原性。

A/Mexico/2009獲得了較強(qiáng)的感染能力。由A/Mexico/2009血凝素蛋白受體結(jié)合位點氨基酸比較可見，其受體結(jié)合位點130環(huán)上氨基酸位點與小規(guī)模流行的流感病毒，例如A/Iowa/2005以及豬源流感病毒等相比發(fā)生了變異，而這種變異結(jié)果是氨基酸序列回歸到1918年和1976年2次大規(guī)模暴發(fā)的H1N1流感病毒的相應(yīng)序列。

3.3 病毒免疫原性變化 A/Mexico/2009病毒糖基化位點未發(fā)生變異或缺失，但是糖基化位點附近部分氨基酸發(fā)生變異，有些氨基酸的類別和極性都有變化。這些變化會影響血凝素蛋白的糖基化，進(jìn)而影響蛋白的免疫原性。

比對血凝素蛋白5個表面抗原區(qū)域氨基酸序列發(fā)現(xiàn):①Sb區(qū)159位點上氨基酸變異最大，不僅病毒之間氨基酸變異頻率最高，而且氨基酸種類和極性相差也很大，顯示了病毒抗原性的多變性。可能與病毒免疫原性關(guān)系密切。②Sa區(qū)193位、Sb區(qū)196位、Ca1區(qū)207位表現(xiàn)出大規(guī)模流行和小規(guī)模流行病毒不一致的情況。A/Mexico/2009在這些位點上氨基酸變異又回歸到1918年和1976年流感病毒，顯示了這些病毒之間的親緣關(guān)系。這可能與病毒感染能力也有一定關(guān)系。③Sa區(qū)158位和Sb區(qū)156位表現(xiàn)出親緣關(guān)系遠(yuǎn)近的特點，親緣關(guān)系較近的幾株病毒保持不變，而親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的(A/Puerto Rico/34)發(fā)生變異。④Sa區(qū)166位、Ca1區(qū)169位、Ca2區(qū)224位及225位、Cb區(qū)78位氨基酸變異與病毒進(jìn)化時間相關(guān)，時間順序相近病毒的相同位點上氨基酸保持一致。

由此可見，應(yīng)重點關(guān)注H1N1流感病毒Sa區(qū)193位、Sb區(qū)196位及159位、Ca1區(qū)207等表面抗原位點氨基酸的變異情況。

3.4 疫苗設(shè)計 在研發(fā)藥物方面，由于流感病毒具有較為復(fù)雜的進(jìn)化規(guī)律，在選擇藥物靶點時一定要參考其宿主情況以及病毒的進(jìn)化規(guī)律;在設(shè)計疫苗方面，對于制備重組病毒，因A/Mexico/2009流感病毒的毒力并不是很強(qiáng)，可將A/Mexico/2009血凝素蛋白基因片段整體重組到工程毒株(如A/Puerto Rico/8/34)中。根據(jù)A/Mexico/2009毒株的特點以及與工程毒株的不同，在制備重組病毒時，應(yīng)重點關(guān)注受體結(jié)合位點130環(huán)137位，表面抗原區(qū)域Sa區(qū)158位，Sb區(qū)156位、159位，Ca1區(qū)169位、173位、207位，Ca2區(qū)144位、224位等位點氨基酸的變異情況。

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(2012-07-10收稿 責(zé)任編輯姜春霞)

Mutation of 2009 type A H1N1 influenza virus hemagglutinin

WU Zhiyin1)，HU Jinsong2)

1)Institute of Medicinal Plant Development，Chinese Academy of Medical Sciences，Beijing 100094 2)Chi-na Development Bank，Beijing 1

influenza virus;hemagglutinin;mutation

Aim:To investigate the evolutionary source and the epidemiological characteristics of the type A H1N1 influenza virus by analyzing the evolution of the hemagglutinin protein.Methods:The hemagglutinin amino acid sequences from the A/Mexico/4108/2009(H1N1)strain and its associated other 22 influenza virus strains were collected and compared using bioinformatic methods，and the evolutionary relationship was analyzed.Results:The A/Mexico/4108/2009(H1N1)hemagglutinin protein was the recombination product during its spread among different hosts.And its protease cleavage site，receptor binding sites，and surface antigenic sites were similar to the H1N1 influenza virus epidemic strains outbreak in 1918 and 1976.Conclusion:It demonstrates the variation of the virulence，transmissibility and immunogenicity of A/Mexico/4108/2009(H1N1)strain，and also indicates the response back to the H1N1 virus epidemic strains in 1918 and 1976.

Q349.53

10.3969/j.issn.1671-6825.2012.05.007

*國家自然科學(xué)基金資助項目 3017004，30421004;國家“973”計劃基金資助項目 2003CB715900