柯野 陳丹 李家洲 謝明權 羅曉春?

(1.華南理工大學生物科學與工程學院，廣東廣州510006;2.廣東輕工職業(yè)技術學院食品與生物工程系，廣東廣州510300)

蛋白酶是一類重要的工業(yè)用酶，占整個工業(yè)用酶量的60%以上;其中，堿性蛋白酶約占蛋白酶總量的一半，廣泛應用于食品加工、皮革、醫(yī)藥和化工等行業(yè)［1］.目前商業(yè)化的堿性蛋白酶主要來源于芽孢桿菌，來源于真菌的極少［2］.米曲霉(Aspergillus oryzae)是一種能產(chǎn)生多種蛋白酶的真菌，據(jù)2007年對該菌的全基因組序列報道，通過對該基因組的分析預測，發(fā)現(xiàn)該菌共有134個蛋白酶基因，其中69個為外肽酶、65個為內肽酶，但只有少數(shù)蛋白酶的功能與性質被解釋清楚［3］.該菌廣泛應用于豆醬、醬油和酒類釀造等發(fā)酵工業(yè).在釀造工業(yè)中，米曲霉產(chǎn)生的酸性蛋白酶活力較低(主要以產(chǎn)生堿性蛋白酶和中性蛋白酶為主)，尤其是堿性蛋白酶對底物蛋白的水解程度對水解物產(chǎn)生的獨特風味和脫苦味起著關鍵作用［1，4-5］.目前，國內外學者對米曲霉的研究主要集中于通過優(yōu)化固體(或者液體)發(fā)酵來提高米曲霉蛋白酶的產(chǎn)量或通過分離純化其產(chǎn)生的部分酶進行性質研究［1，6］.優(yōu)化發(fā)酵條件很難大幅度提高堿性蛋白酶產(chǎn)量，且發(fā)酵過程易受多種因素(如易污染或菌株生長狀態(tài))影響.另外，米曲霉產(chǎn)生的蛋白酶種類較多，這增加了堿性蛋白酶的純化難度，阻礙了其進一步的開發(fā)利用［7］.有關該酶的酶學性質、異源表達和水解特性等的研究目前鮮見報道.

畢赤酵母(Pichia pastoris)表達系統(tǒng)是目前表達異源蛋白性能較好的系統(tǒng)之一，其操作工藝簡單，表達量高.該系統(tǒng)能對表達的蛋白進行折疊和翻譯后修飾，獲得具有活性的目的蛋白，此目的蛋白能直接分泌至發(fā)酵液中便于分離與純化.目前已有較多外源基因在該系統(tǒng)中成功表達的報道［8］.文中主要通過克隆獲得米曲霉堿性蛋白酶基因，以期能在畢赤酵母表達系統(tǒng)中進行異源表達，提高其產(chǎn)量，并對其酶學性質和水解性質進行初步研究，為該重組堿性蛋白酶在相關產(chǎn)業(yè)中的推廣應用奠定基礎，改變目前商業(yè)堿性蛋白酶主要來源于芽孢桿菌的局面，并為開發(fā)利用來源于真菌的堿性蛋白酶提供理論參考.

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 菌株與質粒

米曲霉滬釀3.042菌株購自上海迪發(fā)釀造生物制品有限公司，畢赤酵母KM71菌株和表達載體pPIC9K試劑購自Invitrogen公司.

1.1.2 工具酶和試劑

各種工具酶購自Takara(大連)公司，PCR擴增引物和Trizol試劑購自Invitrogen(廣州)公司，蛋白質分子質量標準物購自Fermentas公司，牛胰島素氧化B鏈購自Sigma公司，其他試劑均為進口或國產(chǎn)分析純.

1.2 試驗方法

1.2.1 米曲霉堿性蛋白酶基因的克隆

將米曲霉菌株接種在裝有麩皮的固體培養(yǎng)基(96.41% 麩皮、0.23% 麥芽糖、1.56% 蛋白胨、0.74%KH2PO4、0.06%FeSO4·7H2O，培養(yǎng)基起始含水量為每克麩皮含1.00 mL水)中，25.0℃恒溫培養(yǎng)48 h.收集菌絲體，用液氮研磨，按Trizol試劑操作手冊提取和鑒定RNA，-70℃保存?zhèn)溆?利用Takara(大連)公司反轉錄試劑盒合成第一鏈cDNA.據(jù)Genbank數(shù)據(jù)庫報道的米曲霉堿性蛋白酶(Alp)基因序列(登錄號:XM_001820092)設計引物.P1引物:5'ATGCAGTCCATCAAGCGTACCT3';P2引物:5'TTAAGCGTTACCGTTGTAGGCAAG3'.以 cDNA為模板，采用P1和P2引物進行50 μL體系的PCR反應.反應程序:94℃變性2min;98℃變性10s，55℃退火15 s，72℃延伸2 min;30個循環(huán)后72℃延伸5min.純化回收PCR產(chǎn)物，克隆至載體 pSIMPLE-18EcoR V/BAP上，轉化至大腸桿菌GT116中，篩選陽性克隆測序確認.

1.2.2 酵母重組表達載體的構建

設計堿性蛋白酶基因的P3和P4引物(該引物擴增的PCR產(chǎn)物不包括堿性蛋白酶基因的信號肽編碼序列).P3引物:5'CCGGAATTCCCTGTGCAGGAAACCCGC3';P4引物:5'CTAGTTTAGCGGCCGCTTAGTGGTGGTGGTGGTGGTGAGCGTTACCGTTGTAGGCAAG3'.P3和P4引物下劃線部分的序列上分別帶有EcoR I和Not I限制性內切酶位點，斜體加粗序列表示增加6個編碼組氨酸標簽的序列.以測序確認后的克隆質粒載體作為模板，以P3和P4為引物進行50μL的PCR反應，反應程序同第1.2.1節(jié);純化回收PCR產(chǎn)物，然后分別對PCR產(chǎn)物與載體pPIC9K進行EcoR I和Not I雙酶切，回收，對酶切產(chǎn)物進行連接，轉化至大腸桿菌GT116中，篩選陽性克隆，測序鑒定，重組質粒命名為pPIC9K/Alp.

1.2.3 重組畢赤酵母的轉化與篩選

將重組質粒pPIC9K/Alp采用限制性內切酶Sac I線性化，電擊轉化至畢赤酵母KM71菌株中，然后涂布于MD平板上培養(yǎng)，挑取培養(yǎng)出的酵母菌落，參照《分子克隆實驗指南》［9］中酵母DNA的快速分離法提取酵母基因組，以酵母基因組為模板，以P3和P4為引物進行PCR擴增驗證.

1.2.4 重組酵母在三角瓶和10 L發(fā)酵罐中的誘導表達

將篩選得到的陽性重組酵母菌株接種于裝有25 mL BMGY培養(yǎng)基(pH=6.0)的250 mL三角瓶中，30℃振蕩培養(yǎng)直至在600 nm波長下的吸光值D(600)約為5～6;然后離心收集菌體，轉接至裝有50mL BMMY培養(yǎng)基(pH=6.0)的500mL三角瓶中，每24h添加1%(體積分數(shù))的甲醇進行誘導表達.誘導結束后，離心收集發(fā)酵上清液，采用Folin酚法測定發(fā)酵上清液中蛋白酶的酶活［10］.酶活定義如下:在40℃下每分鐘水解酪蛋白產(chǎn)生1μg酪氨酸為1個蛋白酶活力單位.通過SDS-PAGE凝膠電泳以及Invitrogen公司的InVisionTMHis-tag In-gel Stain分析鑒定重組表達蛋白酶.

將重組酵母菌株接種于700mL YPD培養(yǎng)基中，30℃振蕩培養(yǎng)至D(600)約為8～10，將培養(yǎng)物接種于裝有6.3 L BSM發(fā)酵培養(yǎng)基的10 L發(fā)酵罐中培養(yǎng).培養(yǎng)過程分為3個階段:(1)甘油培養(yǎng)階段，該階段是為了讓接種后的酵母菌利用發(fā)酵罐中的培養(yǎng)基迅速生長，提高發(fā)酵罐中的菌體濃度，該階段溶解氧含量控制在40%水平，pH=5.0，30℃，培養(yǎng)至發(fā)酵罐中的溶解氧含量陡然上升接近100%;(2)添加甘油階段，該階段添加甘油是為菌體補充碳源，使其菌體濃度進一步增加，來達到酵母菌的高密度發(fā)酵，該階段以12 mL/(L·h)的流速添加50%(質量分數(shù))甘油(混有微量元素)到發(fā)酵罐中，維持數(shù)小時，通過控制攪拌速率、通氣量和罐壓方式維持發(fā)酵罐中的溶解氧含量在20%～35%之間，停止補加甘油后，待發(fā)酵罐中的溶解氧含量升至接近100%，繼續(xù)維持菌體“甘油饑餓”狀態(tài)1h;(3)甲醇誘導表達階段，即甲醇流加進行誘導，重組蛋白酶基因位于AOX啟動子下游，因此添加甲醇可緊密調節(jié)、誘導AOX啟動子啟動，促進外源的堿性蛋白酶基因的表達，并且由于KM71菌株中含有AOX2基因，因此KM71菌株也利用甲醇作為碳源，利于自身的生長，該階段誘導條件為pH=6.0，28.3℃，發(fā)酵罐中的溶解氧含量維持在25% ～30%之間，甲醇流加速度逐漸提高至終速為5mL/(L·h)，定時測定發(fā)酵液的酶活和酵母菌體濕重.

1.2.5 重組堿性蛋白酶的純化

將發(fā)酵上清液置于截留分子質量為6000～8000u的透析袋中，將透析袋置于飽和的PEG 10000水溶液中，4℃靜置至發(fā)酵液濃縮至原來體積的30%左右.將濃縮后的發(fā)酵液pH值調至7.4～8.0后，首先用Ni柱對重組蛋白酶進行親和層析，層析過程中利用緩沖液A(20mmol/L磷酸鈉、0.5mol/L氯化鈉、20～40mmol/L咪唑，pH=7.4)和緩沖液 B(20 mmol/L磷酸鈉、0.5 mol/L 氯化鈉、0.5 mol/L 咪唑，pH=7.4)對Ni柱進行梯度洗脫，收集洗脫液.接著，用超濾離心管濃縮洗脫液，然后加樣于SephadexTMG-75凝膠柱中，采用0.05mol/L磷酸緩沖液洗脫，收集主要蛋白峰的洗脫液，再用超濾離心管濃縮收集，得到純化的蛋白酶溶液，保存?zhèn)溆?

1.2.6 重組堿性蛋白酶的酶譜試驗

參考Till等［11］的方法進行酶譜試驗.在酶譜試驗中，采用12.0%(質量分數(shù))的分離膠(分離膠中含有0.3%酪蛋白)和5.0%(質量分數(shù))的濃縮膠.蛋白酶樣品與上樣緩沖液混合后直接上樣，4℃電泳.電泳后用超純水浸洗凝膠兩次，然后置于0.05mol/L甘氨酸-NaOH(pH 值為 10.0)緩沖液中，40℃酶解30min.采用考馬斯亮藍R-250染色的方法對酶解后的凝膠進行染色及脫色.

1.2.7 pH值和溫度對重組堿性蛋白酶活性及穩(wěn)定性的影響

將純化的重組堿性蛋白酶置于0.02 mol/L pH緩沖液中(乙酸緩沖鹽pH值為3.0～5.0，磷酸緩沖鹽 pH 值為6.0 ～7.0，Tris-HCl pH 值為 8.0 ～9.0，硼砂-氫氧化鈉pH值為9.0～11.0)，然后分別測定其酶活，以確定最適反應pH值.將酶液置于不同的緩沖液中，25℃靜置1 h，然后于pH=10.0條件下測定其酶活，考察不同pH值對酶穩(wěn)定性的影響.

在不同的溫度(40～70℃)下進行重組堿性蛋白酶的酶活測定，以此確定其最適反應溫度.并在其穩(wěn)定的pH條件下，將酶液分別置于不同溫度中保溫10、20、40、60、80 和 120 min，然后測定不同溫度處理后余下的酶活，以考察溫度對重組堿性蛋白酶穩(wěn)定性的影響.

1.2.8 重組堿性蛋白酶對牛胰島素氧化B鏈的水解試驗

參考Bakhtiar等［12］的方法，取牛胰島素氧化B鏈100μg溶解于1mL 0.02 mol/L(pH 值為9.0)乙醇胺-鹽酸緩沖液中，加入一定量酶液(約30U)，混合后放置于40℃水浴中酶解1h，沸水浴5min滅酶活.利用質譜鑒定在胰島素B鏈上的酶切位點.

1.2.9 重組堿性蛋白酶對大豆蛋白和花生蛋白的水解試驗

大豆蛋白和花生蛋白的水解試驗參考潘進權等［13］的方法，分別用 pH 值為8.0 的0.05mol/L 磷酸鹽緩沖液配制5%(質量分數(shù))的大豆分離蛋白和花生分離蛋白，然后在沸水浴中熱處理15 min.冷卻后加入酶，50℃酶解4 h，將酶解液在4000r/min下離心10min，取上清液，采用甲醛滴定法測定其水解度.采用相同的水解試驗方法分別測定木瓜蛋白酶和Alcalase堿性蛋白酶對大豆分離蛋白和花生分離蛋白的水解效率.

2 結果與分析

2.1 堿性蛋白酶基因的克隆和表達載體的構建結果

通過提取米曲霉的總RNA，反轉錄為cDNA，利用P1和P2引物進行PCR擴增出目的條帶;將PCR產(chǎn)物與克隆載體相連接，轉化至大腸桿菌中，挑取陽性克隆測序.測序結果表明克隆的堿性蛋白酶(Alp)基因序列與Genbank數(shù)據(jù)庫中報道序列(登錄號:XM_001820092)完全一致，未見任何突變.

以P3和P4為引物擴增的PCR產(chǎn)物經(jīng)過酶切克隆至表達載體pPIC9K上，再分別以AOX引物(5'AOX:5'GACTGGTTCCAATTGACAAGC3'和3'AOX:5'GGCAAATGGCATTCTGACATCC3')和 P3、P4 引物進行菌落PCR，篩選出陽性克隆，測序結果表明重組質粒pPIC9K/Alp構建成功，其示意圖見圖1.

圖1 重組表達質粒pPIC9K/Alp的構建示意圖Fig.1 Sketch of construction of recombinant expression plasmid pPIC9K/Alp

2.2 重組酵母的篩選和鑒定結果

將限制性內切酶Sac I線性化后的重組表達質粒pPIC9K/Alp電轉至畢赤酵母KM71中，挑取在MD培養(yǎng)基上生長出的單菌落，利用G418抗生素篩選出高拷貝菌株;然后對其培養(yǎng)，提取基因組，以P3和P4引物進行PCR，擴增出目的條帶(見圖2).圖2表明米曲霉堿性蛋白酶基因已成功整合至酵母基因組中.

圖2 酵母轉化子的PCR鑒定結果Fig.2 PCR identification of yeast transformants M—DNA 標準物，DL1000;1，2—PCR 產(chǎn)物

2.3 重組酵母在三角瓶和發(fā)酵罐中的誘導表達結果

外源基因在畢赤酵母中表達的優(yōu)點在于重組蛋白表達量大，分泌至胞外直接進入發(fā)酵液，便于分離純化.本試驗的重組酵母菌株在三角瓶和發(fā)酵罐中誘導表達時，其發(fā)酵液在SDS-PAGE凝膠電泳圖譜的35ku處均有一明顯的蛋白條帶(見圖3(a)).采用Invitrogen公司的InVisionTMHis-tag In-gel Stain試劑對發(fā)酵液的SDS-PAGE凝膠染色曝光，明顯可見在考馬斯亮藍染色的35 ku處具有一白斑(見圖3(b)).該試劑只能與帶有組氨酸標簽的蛋白結合，在紫外線的照射下激發(fā)產(chǎn)生熒光，形成可見的白斑.在構建重組表達質粒時，在堿性蛋白酶的C端設計增加了6個組氨酸標簽，該重組蛋白酶在紫外線照射下可形成白斑.根據(jù)核苷酸序列推導的重組堿性蛋白酶的分子質量接近35ku;而對于整合了未帶外源基因的空表達載體pPIC9K的KM71菌株而言，其發(fā)酵液在SDS-PAGE電泳圖譜的35 ku處未見明顯的蛋白條帶(見圖3(a)).此結果表明重組堿性蛋白酶在KM71中表達成功，電泳圖譜上的35ku處的蛋白條帶是重組堿性蛋白酶條帶.

圖3 重組堿性蛋白酶的電泳圖譜Fig.3 Electrophoretic patterns of recombinant alkaline protease

圖4 重組酵母菌產(chǎn)酶及生長曲線圖Fig.4 Curves of protease activities and growth versus time for recombinant P.pastoris strain

重組酵母菌產(chǎn)酶及生長曲線如圖4所示.由圖4可知，在三角瓶中誘導表達時，誘導至96h后酵母菌濕重達到最高(約45g/L)，然后基本保持穩(wěn)定;誘導至120h時，發(fā)酵液的酶活最高(700U/mL).在發(fā)酵罐中誘導表達時，酵母菌菌體濕重可達約250g/L，顯著高于三角瓶中的濕重，誘導至108 h時，發(fā)酵液酶活達到4100 U/mL，顯著高于三角瓶中發(fā)酵液的酶活.酵母菌是好氧微生物，特別是在高密度發(fā)酵生長時耗氧量更大;由于發(fā)酵罐具備供氧和攪拌裝置，這為酵母菌的高密度生長提供了條件，因此發(fā)酵罐中的菌體濃度高于三角瓶.重組堿性蛋白酶是重組酵母菌自身分泌的胞外蛋白，酵母菌菌體越多，分泌的蛋白酶量越大，因此發(fā)酵罐中發(fā)酵液的酶活高于三角瓶中發(fā)酵液的酶活.工業(yè)上通常以麥麩或稻麩等作為培養(yǎng)基原料，采用固體發(fā)酵米曲霉生產(chǎn)堿性蛋白酶.固體發(fā)酵產(chǎn)酶量一般最高能達到1200U/g［6］，而且發(fā)酵場所大，存在易污染、菌體生長難控制、產(chǎn)生酶種類多且不便于分離純化等不足［7］，因此，采用基因工程手段，構建重組菌株進行液體發(fā)酵來生產(chǎn)重組米曲霉堿性蛋白酶是一種較佳的途徑.

2.4 重組堿性蛋白酶的純化及酶譜試驗結果

重組堿性蛋白酶僅需要幾種純化方式相結合就能從發(fā)酵液中得到純化.首先，將發(fā)酵上清液置于飽和的PEG 10000水溶液中透析，這主要是對重組堿性蛋白酶進行濃縮以及降低發(fā)酵液的黏度，從而為層析做準備.接著，通過Ni柱層析將重組蛋白酶吸附于Ni柱上，而其他大部分雜蛋白通過穿過液被分離掉;然后，對Ni柱進行梯度洗脫，洗脫液中緩沖液B含量為30%時，重組堿性蛋白酶含量最高;最后，利用SephadexTMG-75凝膠層析柱的分子篩排阻效應，對不同分子質量的蛋白進行分離，得到純化的重組堿性蛋白酶.采用SDS-PAGE電泳圖譜對分離純化的樣品純度進行比較分析(見圖3(c))，發(fā)現(xiàn)經(jīng)凝膠層析后，純化的蛋白酶在SDS-PAGE電泳圖譜中僅具有單一條帶，表明該酶已經(jīng)純化至電泳純.

將純化后的重組堿性蛋白酶進行酶譜試驗，電泳圖譜上清晰地顯示一條透明的水解條帶(見圖3(d))，這進一步表明分離純化得到的蛋白是重組堿性蛋白酶.該條帶比SDS-PAGE電泳中的條帶靠后，主要是由于上樣緩沖液和凝膠中均未加SDS以及未對重組堿性蛋白酶進行煮沸的變性處理過程，這使得該酶的表面帶電荷較少以及空間結構未發(fā)生較大改變，因此其電泳速率較慢，水解條帶靠后.

2.5 不同pH值和溫度下重組堿性蛋白酶的活性和穩(wěn)定性

圖5給出了pH值對重組堿性蛋白酶活性及穩(wěn)定性的影響.由圖5結果可知:重組堿性蛋白酶的最適反應pH值為8.5～9.5;重組堿性蛋白酶經(jīng)pH值為6.0～10.0的緩沖液處理后，pH值對其酶活影響不顯著，這表明該酶具有較好的pH穩(wěn)定性;當pH值高于10.0或者低于5.0后，酶穩(wěn)定性明顯下降.

圖5 pH值對重組堿性蛋白酶活性及穩(wěn)定性的影響Fig.5 Effects of pH value on activity and stability of recombinant alkaline protease

圖6所示為溫度對重組堿性蛋白酶活性和穩(wěn)定性的影響.由圖6(a)可知，重組堿性蛋白酶的最適反應溫度為50℃.由圖6(b)可見，該酶在低于40℃的條件下具有良好的穩(wěn)定性，當超過45℃時，該酶會緩慢失活，一旦溫度超過55℃則極不穩(wěn)定，放置20min后活性幾乎完全喪失.

圖6 溫度對重組堿性蛋白酶活性和穩(wěn)定性的影響Fig.6 Effects of temperature on activity and stability of recombinant alkaline protease

2.6 重組堿性蛋白酶對牛胰島素氧化B鏈的水解作用

圖7給出了重組堿性蛋白酶Alp在胰島素B鏈上的切割位點.由圖7可知，重組堿性蛋白酶對牛胰島素氧化B鏈有8個酶切位點，且均比商業(yè)化的3種同家族酶(Subtilisin Novo［12］，Subtilisin BPN'［12］和枯草桿菌蛋白酶［14］)的酶切位點多.對酶切位點而言，除了在之間有共同的酶切位點，其余酶切位點均不相同.根據(jù)Tanford報道的氨基酸殘基的疏水度值計算，發(fā)現(xiàn)不同酶切位點末端氨基酸殘基的疏水度小于3種商品化酶的疏水度［15］，而疏水度越大的氨基酸出現(xiàn)于肽端時，對該多肽的苦味貢獻越大［16］.這表明了重組堿性蛋白酶廣泛的肽鍵選擇和脫苦作用.

圖7 重組堿性蛋白酶Alp在胰島素B鏈上的切割位點Fig.7 Cleavage points of recombinant alkaline protease on oxidized insulin B-chain

2.7 重組堿性蛋白酶對大豆蛋白和花生蛋白的水解試驗結果

不同蛋白酶對大豆蛋白和花生蛋白的水解結果如表1所示.由表1可知，重組堿性蛋白酶對大豆蛋白和花生蛋白的水解程度均高于木瓜蛋白酶，而對花生蛋白的水解程度均高于兩種商業(yè)用酶，這表明重組堿性蛋白酶在實際工業(yè)生產(chǎn)中具有較大的開發(fā)利用價值.

表1 不同蛋白酶對大豆蛋白和花生蛋白的水解結果Table 1 Hydrolysis results of different proteases to soy protein and peanut protein

3 結語

文中探討了米曲霉堿性蛋白酶基因的克隆，并將其在畢赤酵母KM71中成功誘導表達，對表達的蛋白分離純化，并對其酶學性質以及其對大豆和花生蛋白水解特性進行了初步研究.以往文獻發(fā)現(xiàn)，對于霉菌產(chǎn)生蛋白酶而言，固體發(fā)酵產(chǎn)生的酶量高于液體發(fā)酵;對于米曲霉而言，固體發(fā)酵產(chǎn)酶量一般最高能達到1200U/g，在本試驗中，重組堿性蛋白酶在10L發(fā)酵罐中的發(fā)酵液酶活達到4100 U/mL，這表明該重組堿性蛋白酶的表達量高于米曲霉中的表達量;并且該重組蛋白酶直接分泌至發(fā)酵液中，利于該酶的分離和純化.該酶具有較寬泛的pH穩(wěn)定性和較高的熱穩(wěn)定性，對大豆蛋白和花生蛋白的水解能力比商業(yè)化木瓜蛋白酶強，對花生蛋白的水解能力比Alcalase堿性蛋白酶強.以上結果顯示該重組堿性蛋白酶在工業(yè)生產(chǎn)中具有較大的開發(fā)潛力.

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