劉美鳳 谷靈靈 蔣利榮 周惠

(1.華南理工大學(xué)化學(xué)與化工學(xué)院，廣東廣州510640;

2.華南理工大學(xué)廣東省綠色化學(xué)產(chǎn)品技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州510640)

番石榴(Psidium guajava)為桃金娘科番石榴屬植物.番石榴葉資源豐富，化學(xué)成分多樣，不僅有止瀉、降血壓［1］、保護(hù)心臟［2］的作用，還具有明顯的降糖作用，且臨床療效顯著［3-5］.番石榴葉單方制劑“消渴降糖膠囊”已收載于《衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)中藥成方制劑》第十五冊(cè)［6］，用于糖尿病及其并發(fā)癥的臨床防治.但該制劑具體的活性成分和作用機(jī)制尚未明確.

蛋白酪氨酸磷酸酶1B(PTP1B)、激活過氧化物酶體增殖物激活受體γ(PPARγ)、過氧化物酶體增殖物激活受體 α(PPARα)、α-淀粉酶、α-葡萄糖苷酶是與治療糖尿病相關(guān)的靶標(biāo).PTP1B通過對(duì)胰島素受體激酶(IRK)或IRK活性片段的磷酸化絡(luò)氨酸殘基的去磷酸化對(duì)胰島素信號(hào)傳導(dǎo)起負(fù)向調(diào)節(jié)作用［7］，從而阻斷胰島素與受體結(jié)合過程的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)［8］;PPARγ可增強(qiáng)胰島素與其受體結(jié)合的信號(hào)傳導(dǎo)，提高胰島素的敏感性，從而有效降低血糖;PPARα是脂肪代謝的關(guān)鍵調(diào)控因子，廣泛用于肥胖、胰島素抵抗和2型糖尿病的研究中［9］;α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶是抑制碳水化合物水解的酶，可減緩葡萄糖的吸收，從而降低餐后高血糖.目前常用的降糖藥有磺脲類、雙胍類、噻唑烷二酮類、葡萄糖苷酶抑制劑、苯甲酸衍生物類.Fu等［10］從番石榴葉中得到了3種新二醛雜源萜類化合物Psidial A、Psidial B、Psidial C，發(fā)現(xiàn)雖然其對(duì)癌細(xì)胞活性不明顯，但是在濃度為10μmol/L時(shí)，Psidial B、Psidial C對(duì) PTP1B的抑制率分別達(dá)到61.7%、38.8%.這兩種化合物均含有3，5-二醛基倍半萜結(jié)構(gòu)，從而提示番石榴葉二醛雜源萜類化合物中可能含有降糖活性更強(qiáng)的成分或增效物質(zhì).文中采用Accelrys Discovery Studio 2.5中基于CHARMm力場(chǎng)的柔性對(duì)接程序CDOCKER［11］，以從番石榴葉和桉葉中分離得到的13個(gè)二醛雜源萜［12-14］為配體，PTP1B、PPARγ、PPARα、α-淀粉酶、α-葡萄糖苷酶為受體，進(jìn)行降糖活性成分的虛擬篩選，從分子水平上了解小分子化合物的降糖機(jī)理，為番石榴二醛類降糖藥的設(shè)計(jì)和結(jié)構(gòu)修飾提供理論參考，以期為降糖藥物的研發(fā)提供指導(dǎo)和幫助.

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1 小分子配體的準(zhǔn)備

圖1 番石榴葉和桉葉中分離得到的13種二醛雜源萜類化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.1 Chemical structures of 13 dialdehyde meroterpenoid compounds from Psidium guajava and Eucalyptus globulus leaves

首先在畫圖軟件ChemDraw Ultra 7.0中畫出13種二醛雜源萜的結(jié)構(gòu)［10，12-14］(見圖 1)，直接拷貝到Discovery Studio(DS)中.由于配體數(shù)目較多，還要考慮對(duì)映異構(gòu)體等因素，所以采用DS中的Prepare Ligand處理該體系，通過此操作不僅可以對(duì)小分子的構(gòu)象進(jìn)行能量?jī)?yōu)化處理，產(chǎn)生三維結(jié)構(gòu)，加氫，還可以產(chǎn)生異構(gòu)體.13種二醛雜源萜化合物經(jīng)過這樣的處理后產(chǎn)生了53種用于對(duì)接的配體分子.

1.2 蛋白文件的處理

文中所用 PTP1B(2HNP)、PPARγ(3PRG)、PPARα(3FEI)、α-淀粉酶(1PPI)、α-葡萄糖苷酶(2ZEO)的晶體結(jié)構(gòu)均源自布魯克海文蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)，括號(hào)中所示均指代碼.對(duì)上述蛋白的處理如下:使用DS打開下載的晶體三維結(jié)構(gòu)模型，除去水分子;去除蛋白多構(gòu)象，補(bǔ)充非完整的氨基酸殘基，為蛋白添加極性氫;最后給蛋白施加CHARMm力場(chǎng)得到用于對(duì)接的蛋白.

1.3 分子對(duì)接

對(duì)接過程如下:定義蛋白為受體，尋找受體中可能的結(jié)合部位，最大的結(jié)合位點(diǎn)被用于和配體做對(duì)接.當(dāng)對(duì)接完成后，分子對(duì)接的結(jié)果根據(jù)對(duì)接能大小進(jìn)行打分，對(duì)接能是小分子和蛋白的結(jié)合能，該值越小，證明受體與配體的對(duì)接親和力越大，即預(yù)測(cè)小分子與受體結(jié)合的活性越高;另外通過DS軟件分析得到配體與受體的氫鍵數(shù)，洞察那些對(duì)配體結(jié)合有重要貢獻(xiàn)的氨基酸殘基.

2 結(jié)果與討論

2.1 配體與受體的對(duì)接結(jié)果

配體和PTP1B對(duì)接完成后，共產(chǎn)生了70個(gè)對(duì)接位點(diǎn)，詳見表1.

表1 配體與PTP1B的對(duì)接結(jié)果Table 1 Docking results of PTP1B with ligands

Euglobal Iia的親和活性最強(qiáng)，其分子對(duì)接效果見圖2(a).由二維平面圖可知，配體Euglobal Iia二醛結(jié)構(gòu)中的一個(gè)氧原子與受體的Ser216殘基之間存在明顯的氫鍵作用，距離為0.23 nm.苯環(huán)上的羥基與Lys116存在明顯的氫鍵作用，距離為0.18nm.苯環(huán)自身和Arg221形成鍵，距離為0.54nm.另外，配體Euglobal Iia延伸至受體內(nèi)部，被氨基酸殘基包圍，與酶分子形成了較強(qiáng)的疏水作用.

配體與PPARγ分子對(duì)接完成后，共產(chǎn)生了70個(gè)對(duì)接位點(diǎn)，詳見表2.

表2 配體與PPARγ的對(duì)接結(jié)果Table 2 Docking results of PPARγ with ligands

Euglobal Ib的親和活性最強(qiáng)，其分子對(duì)接效果見圖2(b).由二維平面圖可知，配體Euglobal Ib處于 Leu330、Ile326、Ala292、Ile341、Tyr327 等的包圍之中.這可能是因?yàn)檫@些殘基與配體的相互作用增強(qiáng)了配體與受體的結(jié)合能力，從而使該配體的活性提高.

配體與PPARα對(duì)接完成后，共產(chǎn)生了60個(gè)對(duì)接位點(diǎn)，詳見表3.

表3 配體與PPARα的對(duì)接結(jié)果Table 3 Docking results of PPARα with ligands

Euglobal Ic的親和活性最強(qiáng)，其分子對(duì)接效果見圖2(c).由二維平面圖可知，配體Euglobal Ic側(cè)鏈吡喃環(huán)上的氧原子與Ala333形成氫鍵，成鍵距離為0.23nm.

圖2 Euglobal Iia、Euglobal Ib、Euglobal Ic 的分子對(duì)接效果圖(單位:nm)Fig.2 Molecular docking charts of Euglobal Iia，Euglobal Ib and Euglobal Ic(Unit:nm)

2.2 配體與受體的氫鍵數(shù)

通過DS軟件還可觀察對(duì)接位點(diǎn)數(shù)與受體每個(gè)氨基酸殘基形成的氫鍵數(shù).配體在和PTP1B對(duì)接時(shí)，氨基酸殘基 Lys116、Lys120、Arg221、Tyr46 具有重要貢獻(xiàn)，它們與70個(gè)對(duì)接位點(diǎn)形成的氫鍵數(shù)較多，分別是20、16、16和8;配體在和 PPARγ對(duì)接時(shí)有70個(gè)位點(diǎn)，氨基酸殘基 Glu343、Ser342、Ser289、Cys285與這些對(duì)接位點(diǎn)形成的氫鍵數(shù)較多，分別是32、27、19和9;配體在和PPARα對(duì)接時(shí)有60個(gè)位點(diǎn)，氨基酸殘基 Ala333、Thr279、Cys276、Tyr334 與這些對(duì)接位點(diǎn)形成的氫鍵數(shù)較多，分別是33、20、10和8.

2.3 討論

通過分子模擬的方法，篩選番石榴葉中能與PTP1B、PPARγ、PPARα、α-淀粉酶、α-葡萄糖苷酶對(duì)接的二醛雜源萜化合物，結(jié)果發(fā)現(xiàn):

(1)雜源萜類化合物與 PTP1B、PPARγ、PPARα有對(duì)接位點(diǎn)，而與 α-淀粉酶、α-葡萄糖苷酶均無(wú)對(duì)接位點(diǎn).這可能是由于 α-淀粉酶、α-葡萄糖苷酶的結(jié)合空腔過于狹窄，而DS比較適合球形空腔的分子對(duì)接，因此沒有找到對(duì)接位點(diǎn).

(2)13個(gè)二醛雜源萜類成分與PTP1B、PPARγ、PPARα對(duì)接時(shí)分別產(chǎn)生了共70、70、60個(gè)對(duì)接位點(diǎn)，但番石榴葉中的 Diguajadial、Guajadial、Psidial A、Psiguadial A以及EuglobalⅢ、EuglobalⅤ與 PTP1B、PPARγ、PPARα、α-淀粉酶、α-葡萄糖苷酶無(wú)結(jié)合位點(diǎn).分析其結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，苯二醛所連側(cè)鏈比較復(fù)雜，因此無(wú)結(jié)合位點(diǎn)，這可能與其結(jié)構(gòu)復(fù)雜、空間位阻大有關(guān)系.

(3)由表1可知，Psidial B、Psidial C和 PTP1B有對(duì)接位點(diǎn)，這在一定程度上佐證了 Fu等［10］對(duì)Psidial A、Psidial B、Psidial C抑制PTP1B的研究.

(4)來(lái)源于桉葉中的Euglobal Ib、Euglobal Ic、Euglobal Iia這3種小分子物質(zhì)與上述5種受體的結(jié)合活性均較高，這與其結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、空間位阻小有一定關(guān)系，同時(shí)也佐證了文獻(xiàn)所述的桉葉粗提物對(duì)兔具有降血糖的功效［15］.另外，通過分析 Euglobal Ib、Euglobal Ic、Euglobal Iia的結(jié)構(gòu)，可發(fā)現(xiàn)這3種小分子物質(zhì)是同分異構(gòu)體，只是手性有差別.由二維平面圖分析可知，配體中的二醛結(jié)構(gòu)和吡喃環(huán)在對(duì)接的過程中具有重要作用，與受體活性部位間通過鍵、疏水作用和氫鍵作用相互結(jié)合，可為開發(fā)番石榴二醛類降糖藥的結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)和結(jié)構(gòu)修飾提供參考.

(5)通過第 2.2 節(jié)中配體與 PTP1B、PPARγ、PPARα形成的氫鍵數(shù)分析，發(fā)現(xiàn)一些氨基酸殘基在配體與受體的結(jié)合中具有重要貢獻(xiàn)，這對(duì)新藥靶點(diǎn)的發(fā)現(xiàn)和藥物設(shè)計(jì)有重大意義.Thomas等［16］的研究也認(rèn)為，在患者出現(xiàn)糖尿病癥狀之前，血液中酪氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、纈氨酸和苯丙氨酸5種氨基酸水平均出現(xiàn)了異常升高的現(xiàn)象.可見，尚需進(jìn)一步研究與糖尿病密切相關(guān)的氨基酸，這對(duì)糖尿病的預(yù)防和治療將有一定的幫助.

3 結(jié)語(yǔ)

文中采用虛擬篩選的方法研究了13個(gè)二醛雜源萜類化合物與糖尿病相關(guān)靶標(biāo)的相互作用，發(fā)現(xiàn)Euglobal Iia、Euglobal Ib、Euglobal Ic 具有較強(qiáng)的結(jié)合能力，這和它們所含的二醛結(jié)構(gòu)以及吡喃環(huán)有關(guān)，它們可以和周圍的氨基酸殘基通過氫鍵或疏水作用相互結(jié)合.因此，在對(duì)降糖藥物的立體結(jié)構(gòu)改造中可引入二醛結(jié)構(gòu)或吡喃環(huán)，提高其與糖尿病靶標(biāo)對(duì)接的親和性.分子模擬方法針對(duì)性強(qiáng)，是一種較好的藥物篩選手段，是新藥研究和開發(fā)的有效途徑之一，將會(huì)在今后的藥物研究中繼續(xù)發(fā)揮其重要作用.

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