李海昌，白衛(wèi)兵＊，楊培昌，高自壽，何從忠

（1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，云南 昆明 650201；2.楚雄州動(dòng)物疫病控制中心，云南 楚雄 675000；3.云南南華縣動(dòng)物疫病控制中心，云南 南華 675200）

豬繁殖與呼吸綜合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS），又稱豬藍(lán)耳病，是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）引起的以母豬繁殖障礙和仔豬呼吸衰竭為主要癥狀的傳染病，臨床癥狀主要表現(xiàn)為母豬流產(chǎn)、早產(chǎn)、產(chǎn)死胎、產(chǎn)木乃伊胎、仔豬成活率下降和育成豬呼吸道癥狀等[1]。據(jù)報(bào)道，高致病性豬藍(lán)耳病在我國(guó)仔豬發(fā)病率可達(dá)100%、死亡率可達(dá)50%以上，母豬流產(chǎn)率可達(dá)30%以上[2]。自2007年以來，我國(guó)有26個(gè)省份先后發(fā)生了高致病性豬藍(lán)耳病疫情，對(duì)我國(guó)的養(yǎng)豬業(yè)造成了極大的危害和重大的經(jīng)濟(jì)損失[3]。由于豬繁殖與呼吸綜合征病毒免疫機(jī)理復(fù)雜、免疫效果較差，加之該病毒感染豬體后可造成長(zhǎng)期持續(xù)性感染和隱性感染，使豬藍(lán)耳病疫情在我國(guó)部分地區(qū)時(shí)有發(fā)生。此病目前尚無特效藥物可以進(jìn)行治療，主要采取對(duì)癥療法和綜合性的控制繼發(fā)感染措施，但效果有限。在疫病發(fā)生早期，高免血清配合疫苗使用是預(yù)防和治療傳染病的有效措施之一[4]。由于高免血清中含有較高的針對(duì)病原的特異性抗體，能與體內(nèi)相應(yīng)病原發(fā)生特異性中和作用，從而有效地抑制病原的致病作用，使機(jī)體恢復(fù)健康。因此，高效價(jià)、高特異性的抗藍(lán)耳病免疫血清對(duì)控制、預(yù)防和治療豬藍(lán)耳病具有重要意義。本試驗(yàn)對(duì)豬繁殖與呼吸綜合征高免血清的制備及其臨床應(yīng)用進(jìn)行了研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 抗原 豬繁殖與呼吸綜合征滅活疫苗，由北京中農(nóng)生物工程開發(fā)中心生產(chǎn)；豬繁殖與呼吸綜合征弱毒苗，由哈爾濱維科生物技術(shù)開發(fā)公司生產(chǎn)，均購于云南省動(dòng)物疫病控制中心疫苗服務(wù)部。

1.1.2 試驗(yàn)用動(dòng)物 6頭同一品種健康育肥豬。

1.1.3 試劑和儀器 豬繁殖與呼吸綜合征抗體快速檢測(cè)卡，購于深圳市康百得生物科技有限公司；豬繁殖與呼吸綜合征病毒ELISA抗體檢測(cè)試劑盒，購自武漢科前動(dòng)物生物制品有限責(zé)任公司；青霉素、鏈霉素，由云南生物制藥廠生產(chǎn)；雙蒸水、滅菌生理鹽水等，由成都軍事醫(yī)學(xué)研究中心提供；超凈工作臺(tái)、高壓蒸汽滅菌鍋、冰箱、低溫冰箱、離心機(jī)、酶標(biāo)儀（Biorad）、MB病毒滅活過濾器、分裝器等，均由成都軍事醫(yī)學(xué)研究中心提供。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物分組 將6頭同一品種健康育肥豬隨機(jī)分為2組，分別為等量法加強(qiáng)免疫組和倍增法加強(qiáng)免疫組，每組3頭。

1.2.2 免疫方法 免疫程序分為基礎(chǔ)免疫和加強(qiáng)免疫。

基礎(chǔ)免疫：基礎(chǔ)免疫的免疫原為10頭份裝豬繁殖與呼吸綜合征滅活疫苗，每頭豬肌肉注射1.5頭份。加強(qiáng)免疫：于基礎(chǔ)免疫接種后2周進(jìn)行。等量法加強(qiáng)免疫組，每頭豬每次注射2頭份弱毒疫苗，免疫間隔期7d，共加強(qiáng)免疫4次；倍增法加強(qiáng)免疫組，也加強(qiáng)免疫4次，免疫間隔期7d，但第1次加強(qiáng)免疫每頭豬注射2頭份弱毒疫苗，第2次加強(qiáng)免疫注射4頭份，第3次注射8頭份，第4次注射16頭份。

1.2.3 采血及分離血清 在末次免疫后的第3天進(jìn)行采血，耳靜脈采血，37℃溫育1h后，2000 r／min離心10min，吸取血清。用豬繁殖與呼吸綜合征抗體快速檢測(cè)卡，檢測(cè)免疫血清初步效價(jià)，初步效價(jià)達(dá)到1∶80以上為合格。

初步效價(jià)檢測(cè)合格后第7天采血（即末次免疫后的第10天），停食12h后，頸動(dòng)脈放血收集血液于密閉容器中，加入青霉素和鏈霉素，置于室溫下1 h左右，待凝固后，置4℃過夜析出血清，4000 r／min離心15min，在無菌條件下分離血清，病毒滅活過濾器過濾后分裝為5mL／支。檢測(cè)合格后，冷凍儲(chǔ)存、備用。

1.2.4 血清效價(jià)的檢測(cè) 用豬繁殖與呼吸綜合征病毒ELISA抗體檢測(cè)試劑盒檢測(cè)血清抗體效價(jià)，操作方法和判斷方法均按照試劑盒說明書和郭一等[5]報(bào)道的方法進(jìn)行。

1.2.5 安全性檢測(cè) 對(duì)高免血清進(jìn)行無菌檢驗(yàn)和動(dòng)物試驗(yàn)以檢測(cè)其安全性。

1.2.5.1 無菌檢驗(yàn) 取少量制備的抗血清，接種于普通瓊脂平板和血斜面培養(yǎng)基，置37℃水浴鍋培養(yǎng)48h，觀察結(jié)果。

1.2.5.2 動(dòng)物試驗(yàn) 選取健康仔豬、育肥豬、后備母豬各2頭，將制備好的高免血清對(duì)仔豬和育肥豬每頭頸部肌肉注射5mL、后備母豬靜脈注射10 mL，然后連續(xù)測(cè)量體溫14d并觀察其健康狀況。

1.2.6 臨床應(yīng)用試驗(yàn) 按農(nóng)業(yè)部公布的豬繁殖與呼吸綜合征發(fā)病豬的判定標(biāo)準(zhǔn)為診斷依據(jù)，發(fā)病1周以內(nèi)判定為早期病例，發(fā)病1周以上判定為中后期病例。選取同一豬場(chǎng)診斷為豬繁殖與呼吸綜合征的繁育母豬，早期病例和中后期病例各30例進(jìn)行治療試驗(yàn)。每頭每次靜脈注射10mL制備的高免疫血清，同時(shí)為了防治細(xì)菌性病原體的混合感染和繼發(fā)感染，還應(yīng)用了抗生素及解熱鎮(zhèn)痛藥，進(jìn)行控制感染和對(duì)癥治療。

2 結(jié)果

2.1 血清效價(jià)檢測(cè)

從表1可看到，于末次免疫后第3天檢測(cè)免疫血清的初步效價(jià)，結(jié)果等量法加強(qiáng)免疫組3頭豬抗體初步效價(jià)均為1∶80，而倍增法加強(qiáng)免疫組3頭豬抗體初步效價(jià)都是1∶320。于末次免疫后第10天，檢測(cè)抗血清的終效價(jià)，結(jié)果等量免疫組3頭豬都是1∶160，而倍增法免疫組3頭豬抗血清效價(jià)迅速達(dá)到1∶640。

表1 豬繁殖與呼吸綜合征病毒免疫血清的效價(jià)檢測(cè)結(jié)果Table1 The test results of immune serum titre against PRRSV

2.2 安全性檢測(cè)結(jié)果

將制備的血清分別接種普通瓊脂平板和血斜面培養(yǎng)基48h后均無任何細(xì)菌生長(zhǎng)，表明樣品無菌檢驗(yàn)合格。仔豬、育肥豬及后備母豬應(yīng)用制備的免疫血清后均無過敏現(xiàn)象，也無外觀癥狀和病理變化。體溫正常，無發(fā)熱現(xiàn)象，精神狀態(tài)良好，食欲正常。

2.3 臨床應(yīng)用試驗(yàn)結(jié)果

60例病豬用制備的豬藍(lán)耳病高免血清靜脈注射治療均未出現(xiàn)不良反應(yīng)；早期病例30例，經(jīng)1次治療后治愈27例，經(jīng)2次治療后又治愈3例；中后期的病例30例，經(jīng)2次治療治愈19例，經(jīng)3次治療又治愈2例，經(jīng)4次治療又治愈1例，其余8例死亡?？傆行蔬_(dá)86.67%（52／60）。

3 討論

本試驗(yàn)所使用的抗原為正規(guī)廠家生產(chǎn)的豬繁殖與呼吸綜合征滅活苗和弱毒苗，確保了抗血清制備過程中的生物安全性。試驗(yàn)未用強(qiáng)毒進(jìn)行攻毒，而是選用安全可靠的滅活苗和弱毒苗作為免疫原，最終獲得了抗體效價(jià)滿意的免疫血清。

制定合理的免疫程序是獲得高效價(jià)免疫血清制備的關(guān)鍵[6]。為了比較不同免疫程序?qū)贵w水平的影響，試驗(yàn)中基礎(chǔ)免疫都用豬繁殖與呼吸綜合征滅活苗作為抗原，而強(qiáng)化免疫時(shí)參照文獻(xiàn)資料[7－9]，制定了等量法和倍增法兩種加強(qiáng)免疫方案。不同的免疫程序，由于抗原在體內(nèi)的的代謝速度不同，對(duì)免疫系統(tǒng)的刺激強(qiáng)弱也不同，因而產(chǎn)生抗體的水平也就不同[10－12]。結(jié)果倍增法免疫產(chǎn)生的抗體水平比等量法高，但二者相比，等量法所用的抗原量又比倍增法少。所以，兩免疫方案各有利弊。

為了確保制成的免疫血清的安全性，本試驗(yàn)還進(jìn)行了抗血清成品的無菌檢驗(yàn)和動(dòng)物安全性試驗(yàn)。結(jié)果成品無菌檢驗(yàn)合格，動(dòng)物安全性試驗(yàn)表明產(chǎn)品安全性良好。

試驗(yàn)結(jié)果表明，應(yīng)用豬繁殖與呼吸綜合征滅活苗和弱毒苗作為免疫原按一定免疫程序免疫健康育肥豬，所制備的免疫血清效價(jià)最高者可達(dá)1∶640，臨床病例治療有效率達(dá)86.67%。因此，采用該方法制備豬繁殖與呼吸綜合征高免血清是安全有效、切實(shí)可行的，而且成本低廉，在生產(chǎn)實(shí)際中具有一定的應(yīng)用前景。

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