霍志云，童 欽，胡嘉欣，王 煒＊

（1.華威特（北京）生物科技有限公司，北京 100085；2.中國農業(yè)科學院特產研究所，吉林 長春 130122）

牛副流感病毒3型（Bovine parainfluenza virus type 3，BPIV3）屬于單分子負鏈 RNA 病毒目（Mononegavirles）副黏病毒科（Paramyxoviridae）副黏病毒亞科（Paramyxovirinae）呼吸道病毒屬（Respirovirus）的成員[1]，又稱為運輸熱病毒，是引起牛羊呼吸系統(tǒng)疾病的病毒之一[2]。牛副流感病毒在世界各國普遍存在，呈現(xiàn)不同的流行程度，人及其他動物體內均發(fā)現(xiàn)BPIV3的抗體。檢測方法主要有病毒中和試驗、酶聯(lián)免疫吸附試驗、間接免疫熒光及血凝抑制試驗等，其中病毒中和試驗是經典的鑒定BPIV3的血清學檢測方法，該方法敏感性強、特異性高，具有很高的應用價值，許多新建立的方法必需以該方法作為標準進行比較。鑒于3型牛副流感給肉牛和奶牛產業(yè)造成的巨大經濟損失，因此對該病應引起足夠重視。本試驗采用病毒中和試驗方法對中國北方部分地區(qū)牛場的血清樣品進行BPIV3的血清學調查，以掌握牛群中的BPIV3的分布情況，為其防治和凈化提供一定的科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 血液樣本的采集 自內蒙古、吉林、山西采集血液樣本482份，均未免疫接種BPIV3疫苗。

1.1.2 試劑和器材 BPIV3標準株，陰性血清，陽性血清，MDBK細胞，由中國農業(yè)科學院特產研究所人獸共患病實驗室保存；聚苯乙烯管，單道自動移液器，漩渦振蕩器，CO2培養(yǎng)箱，生物安全柜，離心機，水浴鍋，滅菌槍頭。

1.2 方法

1.2.1 血清收集 采集10mL血液樣本離心（1500r／min，15min），收集血清，于－20℃保存。

1.2.2 血清滅活 試驗時，將血清至于水浴鍋中，56℃滅活30min。

1.2.3 血清稀釋 用PBS將血清兩倍倍比稀釋，從1∶2稀釋至1∶4096，每份血清樣品做一個重復。

1.2.4 中和用病毒的稀釋 用DMEM將已知毒價的PI3標準毒進行稀釋，稀釋完成后取100μL加到稀釋好的100μL的血清中，此時標準毒的終濃度應為50TCID50／100μL～300TCID50／100μL。在37℃、體積分數(shù)為5%CO2培養(yǎng)箱中孵育1h。

1.2.5 細胞接種 將96孔細胞培養(yǎng)板培養(yǎng)24h的細胞，棄去生長培養(yǎng)基，每孔加100μL培養(yǎng)基洗板。從培養(yǎng)箱中取出中和1h的培養(yǎng)板，用12道移液器吸取100μL病毒血清中和混合物每列對應加到細胞培養(yǎng)板中。

1.2.6 回滴 利用最終確定的中和用病毒進行回滴試驗，取一新的細胞培養(yǎng)板用稀釋液將中和用病毒1∶1稀釋，與血清病毒中和板一同置于37℃、體積分數(shù)為5%CO2培養(yǎng)箱中孵育，1h后將上述稀釋好的病毒做10倍倍比稀釋，從10－1稀釋到10－3，將長滿單層的細胞培養(yǎng)板棄去培養(yǎng)基，每孔加100μL DMEM洗板，將待回滴的病毒懸液100μL／孔加到細胞培養(yǎng)板，每個稀釋度8孔。從較低濃度到較高濃度添加，并做好空白對照，回歸滴度在同一板在上作1個重復。3d～5d后觀察結果。

1.2.7 記錄與計算 記錄試驗結果，通過Spearman－Karber方法計算血清效價和回歸滴度。

1.2.8 數(shù)據(jù)的統(tǒng)計學分析 所得數(shù)據(jù)用SAS進行分析。

2 結果

2.1 結果判定條件

陰性細胞對照無CPE；陽性對照血清效價在2倍于其確定的平均值之內；陰性血清對照效價＜2，被檢血清效價≥2判定為陽性。

2.2 BPIV3的血清學調查結果

采用病毒中和試驗的方法對采自吉林、內蒙、山西的482份血清，進行BPIV3抗體檢測，檢出陽性血清439份，陽性率為91.08%，不同地區(qū)BPIV3清學調查結果見表1。

表1 北方三省（區(qū)）部分地區(qū)牛血清BPIV3抗體檢測結果Table1 A serological survey of antibodies against bovine parainfluenza virus type 3in three regions of north China

吉林、內蒙、山西BPIV3流行率、標準誤及95%的可信區(qū)間分別為97.35%、2.25、79.31% ～89.31%，84.31%、1.67、91.88% ～98.42% 及95.15%、1.51、94.40%～100%（表2）。

表2 BPIV3血清陽性率的標準誤和95%置信區(qū)間Table2 Standard error and 95%confidence interval for BPIV3seropositive rate

3 討論

牛呼吸系統(tǒng)疾病使肉牛業(yè)和奶牛業(yè)蒙受巨大經濟損失[3]。病毒感染是引起疾病的主要因素，而BPIV3是引起牛呼吸系統(tǒng)疾病最重要的病毒之一。本病很少引起動物的死亡，細菌激發(fā)感染后，引起伴隨肺炎的二重感染。副黏病毒具有潛在的種間傳播的能力。盡管BPIV3有感染人的潛能，但通常認為BPIV3并不是嚴重的人畜共患病[4]。

歐美國家對BPIV3進行了大量的流行病學調查，Intisar K S等[5]采用 BPIV3ELISA 試劑盒，對采自不丹各地的495份駱駝的血清進行抗體檢測，結果發(fā)現(xiàn)血清陽性率平均值為82.2%，血清陽性率最高可達92.6%。H?gglund S等[6]對病毒引起的呼吸道系統(tǒng)疾病進行了6年的研究發(fā)現(xiàn)，BPIV3在牛群中每年都會造成感染，并且具有很高的感染水平，Solís－Calderón JJ等[7]調查發(fā)現(xiàn)墨西哥肉牛BPIV3血清陽性率為85.6%。芬蘭進行的牛血清學調查發(fā)現(xiàn)80%的血清樣本呈BPIV3陽性[8]。采用間接ELISA試劑盒對伊朗的馬什哈德地區(qū)奶牛進行BPIV3的血清陽性進行調查，結果90%的血清呈陽性[9]。但我國尚未對BPIV3流行病學進行大量的調查，因此，對BPIV3流行情況了解甚微。

本研究采用病毒中和的試驗方法，對我國吉林、內蒙和山西的部分牛群進行了BPIV3抗體檢測，血清陽性率分別為97.35%、84.31%、95.15%；與國外近幾年進行的BPIV3血清學調查結果相符和，試驗結果進一步證實BPIV3在牛群中廣泛存在。造成BPIV3血清陽性率高的原因可能有以下幾個方面，首先本病毒是一種高度接觸性傳染病，可以通過呼吸道傳播；其次，動物飼養(yǎng)密度大，一旦引進一頭患病動物，病毒將會在畜群中快速傳播。最后，本病通常引起輕微的臨床癥狀，易被忽視，因此沒有及時采取防控措施，使疾病得有效的控制。

本研究對北方三?。▍^(qū)）的牛群進行抽樣調查，計算各地流行率的平均值、率的標準誤及可信區(qū)間，率的標準誤小，說明抽樣誤差小，表示樣本率對總體率的代表性好，反之，率的標準誤大，樣本對總體率的代表性差。

另外，從BPIV3陽性血清中隨機抽取169份，進行了抗體滴度的測定，山西的BPIV3陽性血清的抗體滴度主要分布在1∶32～1∶64之間，占山西陽性血清樣品數(shù)的91.3%；吉林陽性血清抗體滴度主要集中于1∶16～1∶32，占吉林陽性血清樣品數(shù)的70.1%；內蒙陽性血清抗體滴度主要集中于1∶128，占內蒙陽性血清樣品數(shù)的67.9%（數(shù)據(jù)未顯示），抗體的存在表明牛群目前或近期接觸過病毒，但并不能代表其具有了抵抗力。從北方三省（區(qū)）調查數(shù)據(jù)可見，BPIV3在我國吉林、內蒙、山西牛群中普遍存在，為更詳細的了解本病在我國的流行情況，在全國范圍內進行全面的BPIV3流行病學調查是十分必要的。另外，應增加對本病的關注，采取有效的防控措施，降低病毒在牛群中的傳播水平，保護畜群健康安全。

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[7]Solís－Calderón J J，Segura－Correa J C，Aguilar－Romero F，et al.Detection of antibodies and risk factors for infection with bovine respiratory syncytial virus and parainfluenza virus－3in beef cattle of Yucatan，Mexic[J].J Prev Vet Med，2007，82（1－2）：102－110.

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