5脂氧合酶在食管鱗癌組織中的表達(dá)及其臨床意義

李現(xiàn)杰，王忠民△，張明香

（新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院：1.心胸外科；2麻醉科，河南新鄉(xiāng)453100）

食管癌是上消化道最常見的惡性腫瘤之一，多數(shù)為食管鱗狀上皮細(xì)胞癌（ESCC）。國內(nèi)外近年研究結(jié)果表明，花生四烯酸（arachidonic acid，AA）代謝異常參與腫瘤的發(fā)生。脂氧合酶（lipoxygenase，LOX）代謝通路是參與AA代謝的重要途徑，其關(guān)鍵酶是LOX，5－LOX是其同工酶中的一種，參與多種腫瘤的發(fā)生。但5－LOX在ESCC發(fā)生、發(fā)展中的作用和生物學(xué)意義尚不清楚。本文通過檢測5－LOX基因在ESCC中的表達(dá)情況，分析探討其與ESCC發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系及其臨床生物學(xué)意義。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集2011年5～9月本院心胸外科行食管癌根治術(shù)手術(shù)切除的新鮮ESCC組織標(biāo)本53份（ESCC組）和部分病例相應(yīng)的癌旁組織（距癌組織邊緣大于6cm）36份（對照組），所取組織標(biāo)本均由2位病理學(xué)專家檢查確診。男39例，女14例；年齡43～72（59.0±7.80）歲，所有患者術(shù)前均未行化療和放療。主要試劑：TRIzol試劑、DNA Ladder購自生工生物工程（上海）有限公司；RT－PCR試劑盒購自寶生物（大連）工程有限公司；SP試劑盒、DAB顯色試劑盒購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；兔抗人5－LOX單克隆抗體購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司。設(shè)計引物序列5－LOX上游：5′－CCC GGG GCA TGG AGA GCA－3′，下游：5′－GCG GTG GGG CAG CGT GTC－3′；β－actin 上 游：5′－CTA TTG GCA ACG AGC GGT TC－3′，下游：5′－CTT AGG AGT GGG GGT GGC－3′，擴(kuò)增片段長度分別為416bp和776bp，均由生工生物工程（上海）有限公司合成。

1.2方法

1.2.1RT－PCR檢測5－LOX mRNA表達(dá) 取約100mg組織放入盛有液氮的研缽中研磨，加入1mL TRIzol液研磨成粉末，按照TRIzol RNA提取試劑盒操作說明步驟進(jìn)行，將提取到的總mRNA溶解于40μL經(jīng)DEPC處理過的去離子水中后－80℃冰箱保存?zhèn)溆茫?%瓊脂糖凝膠電泳及紫外分光光度計分析判斷總RNA的完整性及含量和純度。嚴(yán)格按照RNA PCR Kit（AMV）Ver.3.0試劑盒說明書配制反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液，每份反應(yīng)液加入1μL樣品DNA，混勻后在50℃條件下反應(yīng)20min，95℃條件下5min，5℃條件下5min，進(jìn)行1個循環(huán)。再向上述反應(yīng)產(chǎn)物中加入PCR Buffer 10μL、特異下游引物0.5μL及 TaKaRa Ex Taq?HS 0.25μL，并用無菌蒸餾水補至40μL，混勻后用PE2400儀進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。94℃預(yù)變性5min后，按以下反應(yīng)條件進(jìn)行30個循環(huán)：94℃→30s、59℃→30s、72℃→1min，最后72℃延伸7min，4℃條件下保存。以高壓處理后的DEPC水代替樣品mRNA的反應(yīng)體系為空白對照，以β－actin引物代替5－LOX引物的反應(yīng)體系為內(nèi)對照。取上述PCR反應(yīng)產(chǎn)物5μL在1%的瓊脂糖凝膠上，以110V，90mA條件下進(jìn)行電泳約30min，結(jié)果經(jīng)UVIpro紫外凝膠成像及分析系統(tǒng)觀察、掃描、拍照，分析圖片中5－LOX和β－actin的表達(dá)強度，并計算表達(dá)的相對系數(shù)（即5－LOX基因表達(dá)強度/β－actin的表達(dá)強度）。

1.2.2免疫組化SP法檢測5－LOX蛋白表達(dá) 將組織標(biāo)本常規(guī)脫水、石蠟包埋，4μm厚連續(xù)切片，脫蠟至水，再按照免疫組化SP試劑盒說明書進(jìn)行免疫組化染色，一抗工作液濃度以1∶200稀釋，以0.1mol/L PBS代替一抗作陰性對照，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，鹽酸乙醇分化，常規(guī)脫水透明后中性樹膠封片。顯微鏡下觀察染色結(jié)果：以細(xì)胞核、核膜或細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)棕黃色細(xì)顆粒為陽性細(xì)胞。利用圖像分析軟件Image－Pro Plus 5.0分析結(jié)果，測定5－LOX蛋白表達(dá)的灰度值，每片隨機取5個高倍鏡視野，取其平均值記錄為5－LOX蛋白表達(dá)的灰度值。

1.3統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件對所記錄數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。采用s表示，計量資料使用t檢驗及單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

所有標(biāo)本組織經(jīng)RT－PCR產(chǎn)物電泳后，均可觀察到長度為776bp內(nèi)參條帶。ESCC組組織中5－LOX mRNA的相對表達(dá)系數(shù)為0.389～0.982，平均為0.659±0.155，對照組相對表達(dá)系數(shù)為0.216～0.580，平均為0.382±0.108，兩組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；ESCC組組織中5－LOX蛋白表達(dá)的灰度值為46.094～58.549，平均為51.853±3.793，對照組表達(dá)灰度值為31.535～43.535，平均為37.112±3.404，兩組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表1。ESCC組織中5－LOX mRNA表達(dá)水平在高分化組明顯低于中、低分化組，臨床分期為Ⅲ、Ⅳ期的病例明顯高于分期為Ⅰ、Ⅱ期的病例（P＜0.05），此外其表達(dá)水平還與腫瘤的淋巴轉(zhuǎn)移及外膜的浸潤有關(guān)（P＜0.05）；5－LOX蛋白表達(dá)水平也與腫瘤的外膜浸潤、分化程度、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及臨床分期有關(guān)（P＜0.05），見表2。

表1 5－LOX在兩組標(biāo)本組織中的表達(dá)比較（s）

表1 5－LOX在兩組標(biāo)本組織中的表達(dá)比較（s）

53 0.659±0.155 51.853±3.793對照組 36 0.382±0.108 37.112±3.404 t 9.886 19.138 P 5－LOX蛋白表達(dá)灰度值ESCC組組別 n 5－LOX mRNA相對表達(dá)系數(shù)0.000 0.000

表2 ESCC病理特征與5－LOX表達(dá)情況（s）

表2 ESCC病理特征與5－LOX表達(dá)情況（s）

臨床特征 n 5－LOX mRNA相對表達(dá)系數(shù) P 5－LOX蛋白表達(dá)灰度值P外膜浸潤有25 0.715±0.156 0.011 53.255±3.655 0.010無28 0.608±0.139 50.602±3.520分化程度高分化 19 0.562±0.138 0.000 49.525±3.390 0.000中分化 23 0.677±0.122 52.316±3.333低分化 11 0.786±0.148 54.907±2.937淋巴轉(zhuǎn)移有19 0.731±0.173 0.010 53.509±4.024 0.016無34 0.618±0.131 50.928±3.372臨床分期Ⅰ期 1 0.416±0.000 0.014 46.325±0.000 0.036Ⅱ期 26 0.628±0.130 51.202±3.424Ⅲ期 24 0.679±0.159 52.285±3.818Ⅳ期

3 討 論

近年來研究發(fā)現(xiàn)，AA代謝異常與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)［1－4］，AA主要通過環(huán)氧合酶途徑、LOX途徑及細(xì)胞色素P450途徑代謝，產(chǎn)生前列腺素類（PGs）、血栓素 A2（TXA2）、羥二十碳四烯酸（HETEs）和白細(xì)胞三烯（LTs）以及環(huán)氧化二十碳三烯酸（EETs）等代謝產(chǎn)物，統(tǒng)稱為類花生酸。這些產(chǎn)物與腫瘤的發(fā)生、增殖、轉(zhuǎn)移和凋亡等生物學(xué)活性行為密切相關(guān)［5－6］。

5－LOX基因定位于第10號染色體p11.2亞帶，隨合成該酶的白細(xì)胞不同其編碼的蛋白相對分子質(zhì)量為（72～80）×103，5－LOX代謝通路異常可促進(jìn)多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，這一作用已在許多腫瘤組織如胃癌、胰腺癌、結(jié)腸癌、前列腺癌、肺癌和乳腺癌等中證實。5－LOX高表達(dá)能夠促進(jìn)細(xì)胞的惡性增殖、阻止其凋亡，同時可以促進(jìn)腫瘤血管的形成，增強其轉(zhuǎn)移的能力，提高侵襲力。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，給予5－LOX特異性抑制劑后可以顯著抑制腫瘤細(xì)胞的增殖［7－8］。

Hoque等［9］采用免疫組化等技術(shù)對食管癌的研究發(fā)現(xiàn)，5－LOX蛋白在食管癌組織中表達(dá)水平上調(diào)，而且其表達(dá)水平與腫瘤的分化程度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。本文聯(lián)合采用RT－PCR及免疫組化技術(shù)發(fā)現(xiàn)在ESCC組織和癌旁正常食管組織中均有5－LOX表達(dá)，ESCC組織中（其mRNA的相對表達(dá)系數(shù)平均為0.659±0.155，5－LOX 蛋白表達(dá)的灰度值平均為51.853±3.793）呈高表達(dá)，與對照組（mRNA的相對表達(dá)系數(shù)平均為0.382±0.108，蛋白表達(dá)的灰度值平均為37.112±3.404）比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），而且腫瘤分化程度越差其表達(dá)水平越高，5－LOX不僅調(diào)劑正常食管組織的生長，而且在ESCC的發(fā)生中起著更為重要的作用。結(jié)合臨床主要相關(guān)參數(shù)分析發(fā)現(xiàn)5－LOX在腫瘤臨床分期低的較分期高的表達(dá)程度要高，出現(xiàn)外膜浸潤及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移時其表達(dá)水平亦偏高，提示5－LOX的高表達(dá)能夠提高食管癌的轉(zhuǎn)移能力并增強其侵襲力。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移可作為影響腫瘤預(yù)后的獨立因素，5－LOX的高表達(dá)提示食管癌的患者預(yù)后不良。

本研究提示5－LOX可能在ESCC的發(fā)生、發(fā)展中起著重要的作用，對食管癌的臨床診治提供了新的方法和實驗室依據(jù)。近年來利用5－LOX特異性抑制劑治療腫瘤的研究已成為熱點，并有望能夠成為治療ESCC的新途徑。

［1］Goossens L，Pommery N，Henichart JP.COX－2/5－LOX dual acting anti－inflammatory drugs in cancer chemotherapy［J］.Curr Top Med Chem，2007，7（3）：283－296.

［2］Hyde CA，Missailidis S.Inhibition of arachidonic acid metabolism and its implication on cell proliferation and tumor－angiogenesis［J］.Int Immunopharmacol，2009，9（6）：701－715.

［3］Lee YS.Arachidonic acid activates K－Cl－cotransport in HepG2human hepatoblastoma cells［J］.Korean J Physiol Pharmacol，2009，13（5）：401－408.

［4］Oraldi M，Trombetta A，Biasi F，et al.Decreased polyunsaturated fatty acid content contributes to increased survival in human colon cancer［J］.J Oncol，2009（2009）：867915.

［5］Cordray P，Doyle K，Edes K，et al.Oxidation of 2－cys－peroxiredoxins by arachidonic acid peroxide metabolites of lipoxygenases and cyclooxygenase－2［J］.J Biol Chem，2007，282（45）：32623－32629.

［6］Jiang JG，F(xiàn)u XN，Chen CL，et al.Expression of cytochrome P450arachidonic acid epoxygenase 2J2in human tumor tissues and cell lines［J］.Ai Zheng，2009，28（2）：93－96.

［7］張德慶，陳衛(wèi)昌，王磊，等.塞來昔布聯(lián)合5－Fu對人結(jié)腸癌裸鼠皮下移植瘤生長的影響［J］.腫瘤防治研究，2008，35（6）：394－398.

［8］Ihara A，Wada K，Yoneda M，et al.Blockade of leukotriene B4signaling pathway induces apoptosis and suppresses cell proliferation in colon cancer［J］.J Pharmacol Sci，2007，103（1）：24－32.

［9］Hoque A，Lippman SM，Wu TT，et al.Increased 5－lipoxygenase expression and induction of apoptosis by its inhibitors in esophageal cancer：apotential target for prevention［J］.Carcinogenesis，2005，26（4）：785－791.