凝膠滲透凈化–超高效液相色譜–串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定橙汁中鏈格孢霉毒素*

李建華，何強(qiáng)，孔祥虹，樂愛山，吳雙民

（陜西出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心，西安 710068）

凝膠滲透凈化–超高效液相色譜–串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定橙汁中鏈格孢霉毒素*

李建華，何強(qiáng)，孔祥虹，樂愛山，吳雙民

（陜西出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心，西安 710068）

建立橙汁中4種鏈格孢霉毒素含量測(cè)定的凝膠滲透–超高效液相色譜–串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)方法。樣品用乙腈提取后，用填料為Bio-Beads-S–X3的凝膠滲透色譜柱凈化，凈化時(shí)流動(dòng)相采用乙酸乙酯–環(huán)己烷（體積比為1∶1），流速為5 mL/min，測(cè)定時(shí)用超高效液相反相C18色譜柱分離，甲醇–水系統(tǒng)梯度洗脫，采用電噴霧負(fù)離子源和多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）模式定性和定量。4種鏈格孢霉毒素的最低定量限在0.000 4～0.002 mg/kg范圍內(nèi)，加標(biāo)回收率為78.9%～111.5%，測(cè)定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均低于9.0%(n=10)。

凝膠滲透；橙汁；鏈格孢霉毒素；超高效液相–串聯(lián)質(zhì)譜

鏈格孢霉毒素是一類毒性較大的真菌毒素，而且分布廣泛［1］。Rodrigo等從患褐斑病的橙皮中檢出鏈格孢酚（AOH）及鏈格孢酚甲醚（AME）［2］，而橙汁是人們喜愛的飲料之一，如果在橙汁生產(chǎn)過程中原料果選材不嚴(yán)格、采用帶皮壓榨的生產(chǎn)工藝，就有可能在橙汁中引入鏈格孢霉毒素，危害人們的飲食健康。Stefan等采用穩(wěn)定同位素稀釋–液相色譜–串聯(lián)質(zhì)譜法曾經(jīng)從橙汁中檢出AOH和AME［3］，但Rodrigo和Stefan等人僅檢測(cè)了兩種毒素。本研究同時(shí)測(cè)定橙汁樣品中鏈格孢酚（AOH）、鏈格孢酚甲醚（AME）、鏈格孢霉素（ALT）和騰毒素（Tentoxin）4種常見毒素。

文獻(xiàn)報(bào)道，鏈格孢霉毒素檢測(cè)時(shí)樣品凈化方法有固相萃取法［4–7］、QuEChERS法［8］，而采用凝膠滲透色譜（GPC）凈化的方法尚未見有相關(guān)的文獻(xiàn)報(bào)道。筆者利用凝膠滲透色譜對(duì)橙汁樣品中的4種鏈格孢霉毒素進(jìn)行凈化，取得了良好的效果。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與試劑

超高效液相色譜儀：AcquityTM型，配Quattro Premier XE串聯(lián)質(zhì)譜儀、電噴霧電離（ESI）接口，美國Waters公司；

全自動(dòng)凝膠滲透凈化系統(tǒng)：ULTRA型，德國LCTech公司；

甲醇：HPLC級(jí)，德國MERCK公司；

乙酸乙酯、環(huán)己烷：分析純，天津科密歐化學(xué)試劑公司；

氯化鈉：分析純，天津市津北精細(xì)化工有限公司；

無水硫酸鈉：分析純，使用前于650℃灼燒4 h，天津市津北精細(xì)化工有限公司；

鏈格孢霉素、鏈格孢酚、鏈格孢酚甲醚標(biāo)準(zhǔn)品：純度均大于99.0 %，美國Sigma公司；

騰毒素標(biāo)準(zhǔn)品：純度大于99.5 %，英國Apolloscienti fi c公司；

超純水：由美國Millipore公司Milli-Q超純水凈化系統(tǒng)制備。

1.2 儀器測(cè)定條件

（1）色譜條件

色譜柱：ACQUITY BEH C18(50 mm×2.1 mm，1.7 μm，美國Waters公司)；柱溫：35℃；流動(dòng)相采用甲醇–水梯度洗脫，在0～3 min內(nèi)甲醇由35%線性遞增至90%，保持0.5 min，然后在0.2 min內(nèi)恢復(fù)至35%，并保持2 min，整個(gè)過程流動(dòng)相中水的比例相應(yīng)遞減或遞增；流速：0.3 mL/min；進(jìn)樣量：5.0 μL。

（2）質(zhì)譜條件

采用電噴霧離子源負(fù)離子掃描、多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）模式檢測(cè)；鏈格孢霉素定量離子對(duì)為m/z 291.1/247.1，定性離子對(duì)為m/z 291.1/229.0；鏈格孢酚定量離子對(duì)為m/z 257.1/213.1，定性離子對(duì)為m/z 257.1/146.9；騰毒素定量離子對(duì)為m/z 413.4/141.0，定性離子對(duì)為m/z 413.4/271.3；鏈格孢酚甲醚定量離子對(duì)為m/z 271.1/256.1定性離子對(duì)為m/z 271.1/228.1；離子源溫度：115℃；脫溶劑溫度：400℃；脫溶劑氣流量：600 L/h；錐孔氣流量：50 L/h；碰撞室氬氣流量：0.2 mL/min。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

準(zhǔn)確稱取適量的鏈格孢霉素、鏈格孢酚、騰毒素、鏈格孢酚甲醚標(biāo)準(zhǔn)品，分別用乙腈配制成100 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，再利用標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液配制混合標(biāo)準(zhǔn)液，使用時(shí)根據(jù)需要用乙腈–水（體積比為1∶1）逐級(jí)稀釋混合標(biāo)準(zhǔn)液，配制成適當(dāng)濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

1.4 樣品處理

稱取10 g（精確至0.01 g）橙汁于50 mL離心管中，加入4 g氯化鈉，10 mL乙腈，振蕩提取10 min，以3 000 r/min離心5 min，將上層乙腈提取液轉(zhuǎn)移到濃縮瓶中。再分別用10 mL乙腈重復(fù)提取兩次，合并乙腈提取液，于40℃水浴中減壓濃縮至近干，氮?dú)獯蹈?，?0.0 mL乙酸乙酯–環(huán)己烷（體積比為1∶1）溶解殘?jiān)^濾。取5.0 mL濾液用凝膠滲透色譜凈化，凝膠滲透色譜凈化條件：內(nèi)徑25 mm，柱長400 mm，填料為Bio-Beads-S–X3 Beads（38～75 μm）的凝膠柱，流動(dòng)相為乙酸乙酯–環(huán)己烷（體積比為1∶1），流速5.0 mL/min，收集19.0～30.0 min的流出液，40℃減壓蒸至近干，氮?dú)獯蹈?，?.00 mL甲醇–水（體積比為1∶1）溶解定容，過0.2 μm濾膜，供液相色譜–串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定和確證。

2 結(jié)果與討論

2.1 凝膠滲透凈化條件的考察

凝膠滲透色譜利用分子篩的原理對(duì)化合物進(jìn)行分離凈化具有獨(dú)特的凈化效果，在食品安全檢測(cè)領(lǐng)域應(yīng)用廣泛［9］。在檢測(cè)橙汁中鏈格孢霉毒素時(shí)，如果樣品凈化不好，在質(zhì)譜測(cè)定時(shí)會(huì)產(chǎn)生基質(zhì)效應(yīng)，影響定性和定量的準(zhǔn)確性。由于橙汁中含有一定的脂肪和色素，特別是采用帶皮壓榨工藝時(shí)橙皮中的橙皮油會(huì)帶人橙汁中，影響測(cè)定，所以通過實(shí)驗(yàn)考察，選擇去除脂肪和色素效果良好的凝膠滲透色譜進(jìn)行樣品凈化。在凝膠滲透色譜凈化時(shí)，鏈格孢霉素在19.5～25.5 min收集完全；鏈格孢酚在19～27 min收集完全；騰毒素在20～27 min收集完全；鏈格孢酚甲醚在22～30 min收集完全。為保證4種毒素的回收率，最終確定收集時(shí)間為19.0～30.0 min，橙汁樣品凈化良好，基本消除了樣品測(cè)定時(shí)的基質(zhì)效應(yīng)。

在凝膠滲透色譜凈化時(shí)，一般認(rèn)為化合物的流出順序與相對(duì)分子質(zhì)量相關(guān)，相對(duì)分子質(zhì)量越大流出越快［9］，但本實(shí)驗(yàn)中騰毒素的相對(duì)分子質(zhì)量最大（m/z 414.5），鏈格孢酚相對(duì)分子質(zhì)量最小（m/z 258.2），4種毒素的流出順序與相對(duì)分子質(zhì)量大小并不一一對(duì)應(yīng)，這可能與化合物的空間結(jié)構(gòu)及分子擴(kuò)散性質(zhì)有關(guān)，騰毒素相對(duì)分子質(zhì)量雖大，但由于結(jié)構(gòu)緊湊，分子空間體積與其它3種毒素?zé)o大的差異（4種毒素的化學(xué)結(jié)構(gòu)式參見文獻(xiàn)［10］），體積大小均在凝膠顆粒的滲透極限［11］內(nèi)，所以流出順序無顯著差異，而由于4種化合物的擴(kuò)散特性不同，會(huì)造成收集的時(shí)間寬度不同。

2.2 液相色譜條件的優(yōu)化

由于ESI模式需要較低的流動(dòng)相流速，而在低流速下普通液相色譜柱的峰形不佳，所以實(shí)驗(yàn)選用適用于低流速下樣品分離的超高效液相色譜柱，而超高效液相色譜柱目前的粒徑主要有1.7，1.8 μm兩種，長度主要有50，100 mm兩種，由于4種鏈格孢霉毒素在50 mm色譜柱上已能獲得較好的分離，所以最終選用BEH C18柱（50 mm×2.1 mm，1.8 μm）進(jìn)行樣品檢測(cè)。

選擇流動(dòng)相時(shí)，在保證4種鏈格孢霉毒素均能獲得較好的色譜分離及較好的峰形前提下，選用簡便、價(jià)格低廉的甲醇–水系統(tǒng)，實(shí)驗(yàn)中主要對(duì)梯度條件進(jìn)行了考察。由于鏈格孢霉素（ALT）的極性相對(duì)較大，流動(dòng)相中需要較高比例的水才能獲得好的色譜保留，而鏈格孢酚甲醚（AME）的極性相對(duì)較小，流動(dòng)相中需要較高比例的甲醇才能改變色譜峰形，所以為了兼顧不同極性的4種鏈格孢霉毒素，流動(dòng)相需要有較大的梯度變化。實(shí)驗(yàn)中通過不斷調(diào)整，兼顧不同化合物的保留時(shí)間、靈敏度、穩(wěn)定性等指標(biāo)，確定了1.2中的液相色譜流動(dòng)相梯度條件。在1.2條件下4種鏈格孢霉毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液的多反應(yīng)監(jiān)測(cè)離子流圖如圖1所示。

圖1 4種鏈格孢霉毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液的多反應(yīng)監(jiān)測(cè)離子流圖

2.3 線性方程與檢出限

配制濃度為0.01，0.02，0.05，0.1，0.2，0.5，1.0 mg/L的4種鏈格孢霉毒素混合系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，按1.2的液相色譜–串聯(lián)質(zhì)譜條件進(jìn)樣檢測(cè)，并以標(biāo)準(zhǔn)濃度（X，mg/L）為橫坐標(biāo)，定量離子對(duì)峰面積（Y）為縱坐標(biāo)作圖，用最小二乘法進(jìn)行線性回歸，4種毒素的線性相關(guān)系數(shù)（r）均大于0.996，線性關(guān)系均良好。鏈格孢霉素、鏈格孢酚、騰毒素、鏈格孢酚甲醚的線性方程分別為Y=71 466X+92.35，Y=43 221X+601.56，Y=178 392X+3 431.6，Y=509 255X–1 061.5。

將標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋進(jìn)樣，按3倍信噪比（S/N=3）計(jì)算檢出限，4種毒素的檢出限在0.000 6～0.003 mg/L范圍內(nèi)。按10倍信噪比（S/N=6）計(jì)算定量限，4種毒素的定量限在0.002～0.01 mg/L范圍內(nèi)，根據(jù)樣品前處理方法換算，本方法4種毒素的最低定量限在0.000 4～0.002 mg/kg范圍內(nèi)。

2.4 回收率與精密度

加標(biāo)回收試驗(yàn)取空白橙汁樣品，每個(gè)樣品添加0.01，0.02，0.04 mg/kg 3個(gè)水平的4種混合毒素，每個(gè)添加水平重復(fù)測(cè)定10次。回收率及精密度數(shù)據(jù)如表1所示，加標(biāo)回收率均在78.9%～111.5%范圍內(nèi)，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均低于9%。

表1 回收率及精密度測(cè)定結(jié)果（n =10）

2.5 樣品測(cè)定

利用該方法檢測(cè)7批橙汁樣品，其中1批中檢出鏈格孢酚為0.003 3 mg/kg、鏈格孢酚甲醚為0.001 8 mg/kg，另外6批樣品中4種毒素均未檢出。

3 結(jié)語

采用超高效液相色譜–串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定橙汁中鏈格孢霉毒素的含量，首次采用凝膠滲透色譜技術(shù)凈化橙汁樣品中鏈格孢酚、鏈格孢酚甲醚、鏈格孢霉素和騰毒素等4種常見鏈格孢霉毒素，并取得良好的凈化效果，基本消除了樣品檢測(cè)時(shí)的基質(zhì)效應(yīng)，保證了檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確可靠。

參 考 文 獻(xiàn)

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Determination of Alternaria Toxins Residues in Orange Juice by UPLC–MS–MS Coupled with Gel Permeation Chromatography Puri fi cation

Li Jianhua， He Qiang， Kong Xianghong， Yue Aishan， Wu Shuangmin
(Technical Center， Shaanxi Entry –Exit Inspection and Quarantine Bureau， Xi’an 710068， China)

A new method using gel permeation chromatography(GPC) clean up followed by ultra performance liquid chromatography–tandem mass spectrometry (UPLC–MS–MS) was developed for the determination of 4 alternaria toxins in orange juice. Samples were extracted with acetonitrile，then purified by Bio-Beads-S–X3 GPC column with ethylacetate–cyclohexane(volume ratio was 1∶1) as the mobile phase at a fl ow rate of 5 mL/min. The chromatographic analysis was performed on an UPLC reversed-phase C18column using methanol-water as a gradient solvent system. The qualitative and quantitative analysis were performed with negative ions electrospray ionization source and multiple reaction monitoring(MRM) mode. The quantitation limits of the four alternaria toxins were between 0.000 4 mg/kg and 0.002 mg/kg. The recoveries ranged from 78.9% to 111.5% with relative standard deviations less than 9.0%(n=10).

gel permeation chromatography; orange juice; alternaria toxin; UPLC–MS–MS

O657.7+2

A

1008–6145(2012)03–0020–04

10.3969/j.issn.1008–6145.2012.03.006

*國家質(zhì)檢公益性科研項(xiàng)目（200810618）；陜西省農(nóng)業(yè)科技攻關(guān)項(xiàng)目（2010k01–19–4）

聯(lián)系人：何強(qiáng)；E-mail: qianghe12@163.com

2012–02–09