植物組織培養(yǎng)中常見問題與對策

祁建國

摘要：從植物組織培養(yǎng)中常見的污染、褐化、玻璃化現(xiàn)象等問題入手，分析了其形成的原因，并結(jié)合自身工作經(jīng)驗提出針對性的解決策略，對植物的組織快繁和工廠化育苗具有一定的參考意義和借鑒價值。

關(guān)鍵詞：組織培養(yǎng)；污染；褐化；黃化

1 污染問題及對策

1.1 污染原因分析

控制污染是組培過程中的首要技術(shù)。造成污染的原因很多，如外植體的種類、取材的季節(jié)、時間、預(yù)處理方法、消毒藥劑的種類、濃度、消毒時間以及消毒方法、培養(yǎng)基和器皿滅菌、操作人員、工作環(huán)境的要求、超凈工作臺的工作質(zhì)量等都與污染密切相關(guān)。一般來說，組培污染源分為3大類：材料帶菌、接種污染、培養(yǎng)過程感染。

1.2 對策

選擇合理的外植體種類、取材的季節(jié)、時間、初代接種選取大小適宜的外植體。在組培中應(yīng)選取帶菌較少或不帶菌體的材料作為外植體。對母株預(yù)處理，改善植株栽培環(huán)境，對母株噴布殺菌劑或抗生素。改變滅菌方法，使用真空減壓滅菌、多次消毒滅菌、混合消毒液、灼燒等。在培養(yǎng)基中加入其它抑菌劑。切分潛在的帶菌材料時，要保證所用的接種工具已經(jīng)過徹底的消毒；繼代培養(yǎng)時確保污染的材料應(yīng)給予丟棄。針對接種污染，要做到紫外燈接種室消毒，清洗超凈工作臺；接種工具、材料不要與酒精燈、超凈工作臺鐵網(wǎng)面、臺面接觸；接種人員接種時用酒精棉擦手或用濃度為75 %的酒精噴灑雙手，接種時應(yīng)穿上無菌的白大衣，戴上帽子和口罩；無菌室要注重平時除濕和熏蒸消毒工作。培養(yǎng)過程中要定期對培養(yǎng)室進行消毒處理，及時清除污染材料，污染的材料及儀器必須經(jīng)過藥液消毒后方可使用。

2 褐化問題及控制措施

2.1 褐化概念及原因分析

褐化是指在植物組織培養(yǎng)過程中，外植體在誘導(dǎo)脫分化或再分化時，自身組織由其表面向培養(yǎng)基釋放褐色物質(zhì)，以致培養(yǎng)基逐漸變成褐色，外植體也隨之進一步變褐而死亡的現(xiàn)象。褐化一般分為2種：由于細胞受脅迫或其它不利條件影響所造成的細胞死亡而形成的褐化現(xiàn)象；由于酚類物質(zhì)被多酚氧化酶氧化所引起的褐化。影響褐化的因素一般與基因型、外植體情況、培養(yǎng)條件、培養(yǎng)基有關(guān)。如溫度對褐化影響很大，高溫能使 多酚氧化酶的活性提高，促進酚類氧化；而低溫可以抑制酚類化合物的合成，降低多酚氧化酶活性，減少酚類氧化，從而減輕褐化。

2.2 控制措施

多選擇幼齡植株取材，使外植體處于旺盛的生長狀態(tài)，可大大減輕褐變。在植株的一定部位取材，使材料中酚類物質(zhì)含量較低，也有助于減少褐化。對母株進行遮光處理，不僅利于初代培養(yǎng)物的萌發(fā)，還可減輕褐化程度。利用硫代硫酸鈉、植酸、抗壞血酸等抗氧化劑、活性炭等吸附劑能夠阻止多酚氧化物對酚類物質(zhì)的氧化作用，可減少或減輕褐變。實驗證明，瓊脂量的減少、較低的pH值也有利于減少褐變。選取適宜的培養(yǎng)條件如適度的低溫、初培暗光或弱光培養(yǎng)可抑制酚類的氧化，采用45℃以上的短時間高溫處理也能使多酚氧化酶失去活性，達到抗褐變的目的。

3 玻璃化現(xiàn)象及解決途徑

3.1“玻璃化現(xiàn)象”內(nèi)涵及發(fā)生原因

玻璃化現(xiàn)象是指在培養(yǎng)過程中材料呈半透明狀，組織結(jié)構(gòu)發(fā)育畸形的現(xiàn)象。玻璃化的苗因組織畸形，分化能力降低，移栽后也很難成活，所以不宜用作繼代和移栽的材料。它已成為組培工作的一大難題，目前其根本原因尚無定論。根據(jù)吳若菁等[1]對香石竹的組培研究得知，影響組培苗玻璃化的原因主要與激素的種類、濃度、瓊脂的濃度、外植體的取材部位、不適宜的培養(yǎng)條件有關(guān)。

3.2 解決途徑

可從以下幾個方面降低或防止玻璃化現(xiàn)象的發(fā)生。①利用固體培養(yǎng)，調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的 pH值，提高瓊脂濃度，降低培養(yǎng)基的襯質(zhì)勢，造成細胞吸水阻遏，可降低玻璃化；②適當(dāng)提高培養(yǎng)基中蔗糖含量或加入滲透劑，提高培養(yǎng)基的碳氮比，降低 NH4+濃度，降低培養(yǎng)基中的滲透勢，減少培養(yǎng)基中植物材料可獲得的水分；③降低培養(yǎng)器內(nèi)部環(huán)境的相對濕度，保持適宜溫度，改善氧氣供應(yīng)狀況，減少玻璃化苗的出現(xiàn)；④適當(dāng)降低培養(yǎng)基中細胞分裂素和赤霉素的濃度；⑤利用高于40℃的溫度對外植體熱擊處理可消除玻璃化；⑥增加自然光照，實驗證明，玻璃苗放于自然光下幾天后，莖、葉變紅，玻璃化現(xiàn)象可逐漸消失，這可能與自然光中的紫外線有關(guān)；⑦改善培養(yǎng)容器的通風(fēng)換氣條件，如用通氣好的封口膜封口。

4其它問題及相關(guān)對策

如黃化現(xiàn)象和變異率高的問題。培養(yǎng)基中 Fe含量不足、培養(yǎng)環(huán)境通氣不良、培養(yǎng)溫度不適、激素配比不當(dāng)、糖用量不足、光照不足等都會造成黃化現(xiàn)象。只有找出問題的根源對癥下藥才能從根本上解決問題。關(guān)于變異率高的問題，不僅不利于保存資源和培育優(yōu)良的品種，還會嚴重影響工業(yè)化生產(chǎn)的組培苗的質(zhì)量，必須從原始材料、培養(yǎng)基配方、增殖代數(shù)、愈傷組織等方面嚴控變異率的發(fā)生。

參考文獻

1 吳若菁,尤華明,彭東輝. 香石竹組培苗玻璃化控制的研究[J].福建林學(xué)院學(xué)報,1995（4）

(責(zé)任編輯王蔓)