魏鎖成，鞏轉(zhuǎn)娣，董江陵，謝 坤，李瓊毅，韋 敏

(西北民族大學(xué)1.生命科學(xué)與工程學(xué)院;2.醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，甘肅蘭州730030;3.蘭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，甘肅蘭州， 730000)

促性腺激素釋放激素(Gonadotropin-releasing hormone，GnRH)在垂體前葉特異性地與垂體促性腺細(xì)胞上的受體結(jié)合，刺激促黃體素(Luteinizing hormone，LH)和促卵泡素(Follicle-stimulating hormone，F(xiàn)SH)的合成和分泌。然而，下丘腦合成的天然GnRH含量極低微，且不易提取與純化，難以在臨床上推廣應(yīng)用，目前許多學(xué)者提出可用合成的促性腺激素釋放激素類似物(GnRH analogue，GnRH-A)來替代［1］。GnRH-A包括GnRH激動劑(GnRH agonist，GnRHa) 和 GnRH 拮 抗 劑(GnRH antagonist，GnRHant)。GnRH-A具有與天然的GnRH十分相似的生理和生物學(xué)作用，而且與GnRH受體(GnRHR)的結(jié)合力增強100～200倍。阿拉瑞林(Alarelin，又名丙氨瑞林)是一種GnRHa，在動物注射外源性的GnRH和GnRH-A后可提高發(fā)情期受胎率、縮短產(chǎn)后發(fā)情時間、提高家畜超排效果和產(chǎn)仔率［2］，但持續(xù)給予GnRH可以導(dǎo)致垂體-卵巢軸的脫敏反應(yīng)，具有抑制排卵和阻斷發(fā)情周期的抗生育效應(yīng)［3］。動物注射GnRH-A后，對腺垂體嗜堿性顆粒細(xì)胞分泌LH和FSH的活性有無影響，腦垂體、卵巢及子宮器官的組織學(xué)結(jié)構(gòu)是否發(fā)生改變等還未見報道［4］，作用機理尚不清楚［5］。有鑒于此，本研究探討GnRHa主動免疫對激素受體的表達(dá)與生殖激素分泌的作用，為研究GnRH-A免疫調(diào)節(jié)動物機體發(fā)育和生殖功能的機理及合理應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

醋酸阿拉瑞林(Alarelin)，弗氏不完全佐劑，促性腺激素釋放激素抗體試劑盒(Sigam公司);碳二亞胺鹽酸鹽(DC.HCL，上海源葉生物公司);Trizol，Sybr Green qPCR Master Mix(Qiagen 公司)，M-MLV Rtase，DNA聚合酶(AMERSCO公司);PCR試劑盒和RTPCR試劑盒(Invitrogen公司)。促卵泡素(FSH)檢測試劑盒、促黃體激素(LH)檢測試劑盒和促性腺激素釋放激素(GnRH)檢測試劑盒(ADL公司)。

1.2 實驗動物與抗原注射

5～6月齡健康綿羊(小尾寒羊與甘肅省榆中縣本地土中羊雜交的F1代)42只，體質(zhì)量(24.2±2.5)kg，隨機均分為 6 組(n=7)，分別標(biāo)記為EG-Ⅰ、EG-Ⅱ、EG-Ⅲ、EG-Ⅳ、EG-Ⅴ和 CG(對照組)，經(jīng)檢驗組間和組內(nèi)均無顯著差異。預(yù)飼15 d后進(jìn)行正式實驗?？乖闹苽浞椒ㄒ妳⒖嘉墨I(xiàn)［6］。EG-Ⅰ、EG-Ⅱ和EG-Ⅲ分別皮下注射阿拉瑞林抗原200、300和400 μg，0和14 d各1次;EG-Ⅳ和EG-Ⅴ皮下注射阿拉瑞林抗原200、300 μg，0、7、14 和21 d各 1 次(共 4 次);對照組皮下注射藥物的溶媒，0和14 d各1次。

1.3 樣本采集與處理

分別在 0、7、14、21、28、35、45、60 和70 d頸靜脈采血，采血前動物禁食12 h。采集的血樣立即以2 500～3 000 r/min離心 10～15 min，分離血清，－20℃保存。并于70 d頸動脈放血處死，無菌采集垂體、子宮及卵巢。采集的垂體、子宮及卵巢分為3份，第 1份 10%甲醛固定24 h，石蠟包埋、切片(5 μm)、展片、烘干、HE 染色、封固，Motic 顯微鏡下觀察，采集圖像;第2份用3%戊二醛固定，用于電子顯微鏡觀察;第3份迅速移至預(yù)冷的Trizol中，－80℃保存，用于提取mRNA。

表1 GnRHR，F(xiàn)HSR和LHR mRNA引物的設(shè)計Table 1 Primers for GnRHR，F(xiàn)HSR and LHR mRNAs

1.4 生殖激素測定

嚴(yán)格按照FSH檢測試劑盒、LH檢測試劑盒和GnRH檢測試劑盒(ELISA)的操作說明，用酶標(biāo)儀分別測定不同時間的血清GnRH、FSH和LH的吸光度，并用回歸方程計算濃度。

1.5 設(shè)計的引物

從GenBank中獲得綿羊GnRHR基因mRNA(LOC443413)、FSHR基因 mRNA(L12767.1)和LHR基因mRNA(L36329.1)序列，用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計引物(由上海生工合成)。內(nèi)參選用綿羊甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)(表1)。

1.6 腺垂體總RNA的提取

取凍存于－70℃的垂體組織，Trizol破碎，勻漿后加入0.2 mL氯仿，振蕩15 s，靜置3 min。4℃12 000×g，離心10 min，取上清。加入0.5 mL異丙醇，混勻，冰上靜置20～30 min。4℃，12 000 r/min，10 min，棄上清。加入1 mL 75% 乙醇，洗滌沉淀。4℃，7 500×g×5 min，棄上清。室溫放置晾干或超凈臺中吹干5 min左右，加入適量的Rnase-free H2O溶解。用1.2%瓊脂糖凝膠150 V和100 mA 20 min電泳觀察。

1.7 PCR擴(kuò)增條件與實時熒光定量PCR(FQPCR)

用25μL體系。SybrGreen qPCR Master Mix，2X，12.5 μL;引物 F(10 μmol/L)，0.5 μL;引物 R(10 μmol/L)，0.5 μL;ddH2O，9.5 μL;Template(DNA)2 μL;總體積25 μL。每25 μL體系加2 μL DNA 模板。94℃ 5 min，95℃ 2 min，95℃ 10 s，60 ℃ 40 s，72℃ 10 min，40個循環(huán)。

GnRHR、FSHR和LHR的RNA提取和純化后，經(jīng)PCR擴(kuò)增與反轉(zhuǎn)錄。通過對引物濃度、熒光RTPCR循環(huán)參數(shù)等進(jìn)行一系列優(yōu)化，確立SYBR GreenⅡ工作濃度和反應(yīng)體系(25 μL)。FQ-PCR反應(yīng)條件:95 ℃ 15 min，95 ℃ 30 s，55 ℃ 45 s，40個循環(huán)。完成上述步驟后，把加好樣品的96孔板放在ABI Step one plus型熒光定量PCR儀中進(jìn)行反應(yīng)。以實驗組 GnRHR、FSHR 和 LHR mRNA 的 2－(ΔΔCt)與對照組2－(ΔΔCt)的比值計算其相對表達(dá)量，其中 Ct表示基因擴(kuò)增產(chǎn)物達(dá)到設(shè)定閾值所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)，ΔΔCt=實驗組Ct(目的基因Ct－內(nèi)參基因Ct)－對照組Ct(目的基因Ct－內(nèi)參基因Ct)。

1.8 統(tǒng)計學(xué)分析

用Spss 18.0統(tǒng)計軟件包處理數(shù)據(jù)，用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，以 χ2檢驗、單因子方差分析(Tukey HSD)和多重比較進(jìn)行顯著性檢驗。

2 結(jié)果

2.1 實時熒光定量PCR相對定量結(jié)果

各實驗組GnRHR mRNA、FSHR mRNA和 LHR mRNA 的 2－(ΔΔCt)均低于對照組，隨著 GnRHa 注射劑量的增加，EG-Ⅰ、EG-Ⅱ和 EG-Ⅲ的 2－(ΔΔCt)值逐漸下降(表2);而且，EG-Ⅳ與 EG-Ⅰ、EG-Ⅴ和 EG-Ⅱ相比較，EG-Ⅳ和 EG-Ⅴ(注射 alarelin 4次)Gn-RHR mRNA、FSHR mRNA 和 LHR mRNA 的 2－(ΔΔCt)值分別低于EG-Ⅰ和EG-Ⅱ(注射alarelin 2次)受體mRNAs的2－(ΔΔCt)(P＜0.05)，表明加大阿拉瑞林抗原的注射劑量和增加注射次數(shù)均會抑制垂體GnRHRmRNA、FSHR mRNA和LHR mRNA的表達(dá)。

表2 GnRHR、FSHR和LHR mRNA實時熒光定量PCR結(jié)果Table 2 Values of fluorescence quantitative PCR for GnRHR、FSHR and LHR mRNAs(±s，ng/L)

表2 GnRHR、FSHR和LHR mRNA實時熒光定量PCR結(jié)果Table 2 Values of fluorescence quantitative PCR for GnRHR、FSHR and LHR mRNAs(±s，ng/L)

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，＊＊＊P＜0.001 compared with CG.

mRNA(Ct)GAPDH(Ct)group ΔΔCt 2 －(ΔΔCt)GnRHR FSHR LHR GnRHR FSHR LHR GnRHR FSHR LHR GnR HR FSHR LHR CG 26.75 33.75 30.47 24.81 24.01 24.81 0 0 0 1 1 1 EG-Ⅰ 24.65 35.80 31.08 21.93 24.81 24.01 0.78 1.25 1.41 0.58* 0.42* 0.38*EG-Ⅱ 24.91 33.90 29.9 21.67 21.12 21.12 1.30 3.04 3.12 0.41* 0.12＊＊ 0.12＊＊EG-Ⅲ 24.64 35.73 33.15 21.12 22.57 22.57 1.58 3.42 4.92 0.33＊＊ 0.09＊＊＊ 0.03＊＊＊EG-Ⅳ 26.87 34.39 29.87 24.01 21.93 21.93 0.92 2.72 2.28 0.53* 0.15＊＊ 0.21＊＊EG-Ⅴ 26.03 34.62 31.58 22.57 21.67 21.67 1.52 3.21 4.25 0.35＊＊ 0.11＊＊ 0.05＊＊＊

2.2 血清GnRH濃度

對照組血清GnRH含量保持穩(wěn)定，免疫后45 d之內(nèi)，實驗組血清GnRH濃度持續(xù)下降，EG-Ⅰ和EG-Ⅱ在 21 和28 d達(dá)到谷值(P＜0.05)，EG-Ⅲ、EG-Ⅳ和EG-Ⅴ則在45 d達(dá)到谷值(P＜0.01)，且以EG-Ⅴ為最低。谷值之后逐漸上升趨勢，70 d時達(dá)到免疫注射前水平。表明GnRHa主動免疫對母羊GnRH的分泌有抑制作用，而且隨著注射劑量和注射次數(shù)的增加，這種作用更加明顯(圖1)。

圖1 血清GnRH濃度Fig 1 Serum concentrations of GnRH(±s，ng/L)

2.3 血清FSH濃度

從14 d開始實驗組的血清FSH濃度也逐漸升高，EG-Ⅰ(P＜ 0.05)、EG-Ⅱ(P＜ 0.01)和 EG-Ⅲ(P＜0.01)分別28、35和35 d達(dá)到峰值，而 EG-IV和EG-V在45和60 d達(dá)到高峰值(P＜0.01)。整個實驗期間實驗組始終高于對照組(P＜0.05)，尤其是EG-V效果更顯著(圖2)。表明多次注射GnRHa可以增強FSH的合成與分泌，而且注射劑量大作用更明顯。對照組血清FSH濃度呈輕度增加趨勢。

圖2 母綿羊血清FSH測定值Fig 2 The concentration of serum follicle stimulating hormone in ewes(±s，ng/L)

2.4 血清LH濃度

對照組血清LH含量保持基本恒定，實驗組綿羊血清 LH 呈下降趨勢，EG-Ⅰ(P＜0.01)、EG-Ⅱ(P＜0.05)和 EG-Ⅲ(P＜0.05)分別在 21、21 和28 d達(dá)到谷值(P＜0.05)，EG-Ⅳ和 EG-Ⅴ在35 d達(dá)到谷值(P＜0.01)。然后逐漸升高，至70 d時恢復(fù)到注射前水平。35 d時EG-Ⅳ和EG-Ⅴ低于EG-Ⅰ、EG-Ⅱ和EG-Ⅲ(圖3)。表明GnRHa抗原免疫對垂體分泌與釋放LH有抑制作用，而且隨著注射劑量和注射次數(shù)的增加，這種作用更加明顯。

2.5 血清E2濃度

整個實驗期間實驗組和對照組血清E2含量無明顯變化，各組間無顯著差異。

圖3 綿羊血清LH測定值Fig 3 The concentration of serum luteinizing hormone in ewes(±s，IU/L)

3 討論

GnRHa對體外培養(yǎng)的卵巢細(xì)胞分泌固醇類激素具有抑制作用，GnRHa能穿透卵泡膜進(jìn)入卵泡液，影響顆粒細(xì)胞的功能及卵子的成熟［7］。應(yīng)用GnRH-A可抑制垂體GnRHR，LHR和FSHR mRNA的表達(dá)［8－9］。然而，對GnRHa免疫注射后激素受體mRNA的表達(dá)和分布是否發(fā)生改變迄今未見研究報道，其機理尚不清楚［10］。GnRH抗體與GnRHR結(jié)合，使垂體中 GnRHR明顯減少，影響了內(nèi)源性GnRH與GnRHR的結(jié)合，改變了激素的作用。本實驗證明綿羊腺垂體中有豐富的RNA，GnRHa主動免疫綿羊后，實驗組GnRHR、FSHR和LHR mRNA值均低于對照組，EG-Ⅳ和EG-Ⅴ的mRNA值低于EG-Ⅰ和EG-Ⅱ。由于GnRH免疫減少了垂體GnRH的表達(dá)水平，可以引起性腺激素含量及生殖行為的改變［12］。用GnRH免疫公羊和母羊后，外周血液中LH和FSH水平與對照組相比明顯降低［11］。本實驗證實，Alarelin主動免疫母羊后，血清GnRH和LH濃度初期逐漸降低到谷值，而后逐漸上升。實驗期間，實驗組血清FSH始終高于對照組，而E2濃度無顯著差異。雌激素由卵巢中卵泡的顆粒細(xì)胞和膜細(xì)胞合成，不同的卵泡階段雌激素的分泌量不同。在女性月經(jīng)周期中，血液中雌激素的水平發(fā)生周期性變化。卵泡期開始時，血中雌激素濃度較低，對FSH和LH的反饋抑制較弱。在排卵前1周左右，血中雌激素濃度明顯上升，至排卵前1天左右雌激素濃度達(dá)到頂峰，下丘腦增加GnRH的分泌，并刺激FSH與 LH 的分泌［1，13］。然而，這種現(xiàn)象在母綿羊中是否同樣出現(xiàn)，與羊的品種及發(fā)情周期等有關(guān)尚需深入研究。本實驗結(jié)果與使用甾體激素、第三腦室灌注 GnRH［14］以及在家兔的相關(guān)研究結(jié)果相似［6，15］。

總之，阿拉瑞林主動免疫可抑制垂體GnRHR mRNA、FSHR mRNA和LHR mRNA的表達(dá)，促進(jìn)垂體合成與釋放FSH，增加血清FSH含量，降低GnRH和LH濃度。增加阿拉瑞林抗原的免疫劑量和注射次數(shù)，作用更加明顯。本研究為合理應(yīng)用GnRH類似物調(diào)節(jié)生殖功能和治療卵巢及子宮疾病提供了科學(xué)依據(jù)。

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