桂 玲，王 靜，祝愛珍，劉成成，劉革修

(1.湖南省腫瘤醫(yī)院婦瘤科，湖南長沙410006;2.暨南大學醫(yī)學院血液病研究所，廣東廣州 510632)

最近研究發(fā)現(xiàn)，卵巢癌中存在卵巢癌干細胞(cancer stem cells，CSCs)［1］，且與卵巢癌發(fā)生發(fā)展及其多藥耐藥密切相關［2］。這些研究結果提示，卵巢癌干細胞是卵巢癌防治過程中重要靶細胞。

NAC-1(nucleus accumbens-1)蛋白屬于BTB/POZ轉錄因子家族成員，通過BTB/POZ結構域形成二聚體，與一些核蛋白相互作用，調節(jié)細胞生物學活性，參與胚胎干細胞的自我更新和多能性分化。在漿液性卵巢癌組織和細胞系中NAC-1表達和紫杉醇體外耐藥相關，NAC-1通過部分抑制Gadd45gip1的表達、負向調節(jié) Gadd45腫瘤抑制途徑的組成，包括Gadd45α及其結合蛋白Gadd45gip1，從而促進腫瘤的生長和存活［3］。所以，本研究探究增強卵巢癌治療效果的輔助方法，為提高臨床卵巢癌治療效果提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑:人卵巢癌細胞系HO8910(中國科學院上海細胞生物研究所，由暨南大學生命科學技術學院生殖研究室保存);RPMI-1640培養(yǎng)液(Gibco公司);新生胎牛血清(杭州四季青生物工程科技有限公司);MTT(Sigma公司);脂質體轉染試劑盒LipofectamineTM2000(Invitrogen公司);Trizol、反轉錄試劑盒和SYBR GreenⅠMix試劑盒(Tiangen公司)、MTT試劑盒、蛋白裂解液和電化學發(fā)光(electrochemilum-inescence，ECL)試劑盒(碧云天生物技術有限公司);特異性siRNA和陰性對照siRNA(廣州市銳博生物科技有限公司)。

1.2 靶向NAC-1基因寡核苷酸的設計:根據(jù)NAC-1基因的序列號NM 052876.21設計2條特異性siRNA序列:NAC-1 siRNA-1 為5'-UGACAGGCACCAACGUGUACA-3'，NAC-1 siRNA-2為5'-GAACUCGGUGCCCUUCUCCAU-3';另外設計一條陰性對照，與已知的人類基因無同源性，序列為5'-GACTT CATAAGGCGCATGC-3'。

1.3 細胞培養(yǎng)和轉染:將人卵巢癌細胞系HO8910細胞以1×106個/孔接種于6孔板，用含10%胎牛血清的 RPMI 1640培養(yǎng)液培養(yǎng)于CO2體積分數(shù)為5%的37℃培養(yǎng)箱中。當細胞生長至約70%匯合度時，參考試劑盒說明書，用脂質體分別轉染各種siRNA(50 nmol/L)。實驗分組:空白對照(control)組、陰性siRNA(negative siRNA)組和NAC-1 siRNAs(包括 NAC-1-siRNA-1、2)組。

1.4 MTT法檢測細胞增殖活性:收集轉染48 h后的細胞，將細胞重懸，以5×103個/孔接種于96孔板，每孔100 μL，并設置3個復孔。繼續(xù)培養(yǎng)細胞0、24、48、72和96 h后，每孔加入MTT液20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，低速離心10 min棄上清液，每孔加入150 μL DMSO，振蕩使沉淀充分溶解，在酶標儀490 nm波長處檢測吸光度(A)值，計算細胞增殖抑制率:細胞增殖抑制率 =(1－轉染組 A490nm/空白對照組 A490nm)×100%。

1.5 克隆形成實驗檢測細胞生長情況:轉染48h后，收集細胞、重懸，以3×102個/孔接種于6孔板繼續(xù)培養(yǎng)，每隔3 d換1次培養(yǎng)液。10 d后終止細胞培養(yǎng)，PBS清洗3次，多聚甲醛溶液固定，0.1%結晶紫染色10 min后，顯微鏡下計數(shù)含大于10個細胞的細胞克隆數(shù)，計算克隆形成率。克隆形成率=克隆數(shù)/接種細胞數(shù)×100%。

1.6 FCM法檢測細胞周期:用0.25%胰蛋白酶收集轉染48 h后的細胞，用PBS洗滌細胞后，加入1 mL70%乙醇4℃固定過夜，PBS洗滌細胞1次，重懸細胞于500 μL PBS，加入碘化丙啶(propidiumiodide，PI)染色液(含RNA酶)，終濃度50 mg/L，避光染色30 min，300目尼龍網(wǎng)過濾后使用流式細胞儀計數(shù)各細胞周期的細胞數(shù)。

1.7 實時熒光定量RT-PCR法檢測NAC-1 mRNA表達:siRNA轉染48 h后收集細胞，提取總RNA、并用紫外分光光度計定量，取1 μg反轉錄合成cDNA。以cDNA為模板、NAC-1基因特異性引物進行實時熒光定量PCR分析，根據(jù)2－△△Ct方法分析目的基因的mRNA相對表達水平。NAC-1基因上游序列為 5'-CCAGACACTGCAGATGGAGA-3'，下游序列為5'-AAGCTGAGGATCTGCTGGAA-3'，擴增片段為227 bp;內(nèi)參GAPDH上游序列為5'-GAGTCAACGGATTTGGTCGT-3'，下游序列為5'-TTGATTTTGGAGGGATCTCG-3'，擴增片段為219 bp。

1.8 Western印跡法檢測NAC-1蛋白表達:siRNA轉染48 h后收集細胞，提取細胞總蛋白，采用BCA法進行蛋白定量。取等量蛋白30 μg上樣，進行12%的SDS-PAGE，120 V恒壓電泳1 h，200 mA恒流轉膜1 h，含5%脫脂奶粉的TBST對膜封閉30 min，加入鼠抗人NAC-1(1∶200)或兔抗人GAPDH抗體于4 ℃孵育過夜((Sigma，Cat#G9545，1∶4 000)，次日加入辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)標記的相應二抗IgG(稀釋比例為1∶3 000)于室溫孵育1 h，TBST 洗膜10 min×3次。最后，ECL發(fā)光顯色，X色膠片曝光，采集圖像，采用 Gelpro4.0軟件對目的蛋白進行定量分析。以GAPDH作為內(nèi)參對照。

2 結果

2.1 siRNA轉染對卵巢癌HO8910細胞NAC-1基因表達水平的影響:轉染 NAC-1特異 siRNA的2組都能顯著沉默NAC-1基因的表達(P＜0.05)，其中，轉染NAC-1-siRNA-1后，NAC-1mRNA和蛋白表達水平最低(圖1A，B)。因此，后續(xù)實驗選擇NAC-1-siRNA-1進行基因轉染。

2.2 NAC-1 siRNA轉染對卵巢癌HO8910細胞細胞增殖的影響:轉染48、72和96 h后，NAC-1-siRNA-1組 HO8910細胞增殖開始受到明顯抑制，增殖抑制率分別為(28.60±6.33)%、(39.95±7.83)%和(42.87±9.29)%(P＜0.05);而轉染陰性siRNA對HO8910細胞增殖無明顯影響?？寺⌒纬蓪嶒灲Y果與MTT檢測結果具有一致性，轉染NAC-1-siRNA-1后HO8910細胞的克隆集落數(shù)為(38.67±4.83)，顯著低于空白對照組和陰性對照組克隆集落數(shù)(89.81±5.47)和(90.24±5.65)(P＜0.05)。

2.3 NAC-1 siRNA轉染對卵巢癌HO8910細胞細胞周期分布的影響:空白對照組與陰性siRNA組中卵巢癌HO8910細胞細胞的細胞周期分布無差異，而轉染NAC-1-siRNA-1后G1期HO8910細胞比例顯著增高(P＜0.05，圖2，表1)。

表1 NAC-1 siRNA轉染對卵巢癌HO8910細胞細胞周期分布的影響Table 1 Effect of NAC-1 siRNA transfection on cell cycle distribution of ovarian cancer HO8910 cells(±s，%，n=3)

表1 NAC-1 siRNA轉染對卵巢癌HO8910細胞細胞周期分布的影響Table 1 Effect of NAC-1 siRNA transfection on cell cycle distribution of ovarian cancer HO8910 cells(±s，%，n=3)

*P＜0.05 compared with the control group.

group G0/G1G2 S G2/M control 42.38±5.73 24.92±4.47 31.70±4.74 negative siRNA 45.68±5.95 22.45±4.60 31.87±4.66 NAC-1 siRNA-1 62.53±6.73* 12.99±3.10*24.48±3.84

3 討論

研究發(fā)現(xiàn)，NAC-1與胚胎干細胞的多能分化有關，調節(jié)其他多能分化因子的表達，如 Nanog、Oct4、Sox2、Klf4、Sall1 和Sall4等，參與蛋白質間的相互作用和轉錄調控網(wǎng)絡，參與胚胎干細胞的自我更新和多能性分化，對胚胎干細胞的多能分化是至關重要的。研究顯示，NAC-1在多種惡性腫瘤中表達上調，包括:胰腺癌、大腸癌、乳腺癌、腎細胞癌、肝癌和宮頸癌。在卵巢癌中發(fā)現(xiàn)化療后復發(fā)的患者體內(nèi)NAC-1表達水平明顯高于初發(fā)未治者，NAC-1表達和紫杉醇體外耐藥相關［3］;NAC-1通過部分抑制 Gadd45gip1的表達、負向調節(jié)Gadd45腫瘤抑制途徑的組成包括Gadd45α及其結合蛋白Gadd45gip1，從而促進腫瘤的生長和存活［3］。這些資料表明，NAC-1是高度惡性的卵巢癌復發(fā)相關基因。所以，通過抑制其表達、抑制卵巢癌細胞生長活性，反轉藥物耐藥性是一個誘人的目標。

本研究通過脂質體轉染方法將NAC-1 siRNA-1、siRNA-2分別導入卵巢癌細胞后，發(fā)現(xiàn)目的基因NAC-1 mRNA及其蛋白表達下調、細胞的生長活性明顯受到抑制，且細胞周期被阻滯于G1期，其中NAC-1 siRNA-1比siRNA-2的作用更為明顯。本研究表明，NAC-1在腫瘤細胞的生長和存活中起著非常重要的作用。推測NAC-1基因可能成為治療卵巢癌的一個新靶點。后續(xù)研究將深入探討利用NAC-1 siRNA-1提高卵巢癌細胞對化療藥物的敏感性問題。

［1］Hu L，McArthur C，Jaffe RB.Ovarian cancer stem-like side-population cells are tumourigenic and chemoresistant［J］.Br J Cancer，2010，102:1276 －1283.

［2］Kobayashi Y，Seino K，Hosonuma S，et al.Side population is increased in paclitaxel-resistant ovarian cancer cell lines regardless of resistance to cisplatin［J］.Gynecol Oncol，2011，121:390－394.

［3］Ishibashi M，Nakayama K，Yeasmin S，et al.A BTB/POZ gene，NAC-1，a tumor recurrence-associated gene，as a potential target for Taxol resistance in ovarian cancer［J］.Clin Cancer Res，2008，14:3149－3155.