鄧 芳，郭海英，支 軼，連小華，楊 恬*

(1.第三軍醫(yī)大學(xué)細胞生物教研室;2.西南醫(yī)院全軍泌尿外科研究所，重慶 400038)

白發(fā)是人和哺乳動物衰老的一個明顯體征，了解其形成的原因?qū)α私馑ダ系臋C制提供理論依據(jù)。毛發(fā)具有周期性生長的特性［1］，其毛干結(jié)構(gòu)的更替伴隨著周期性的色素形成［2－3］。黑色素譜系細胞周期性的激活、分化、增殖、遷移及合成、呈遞黑色素給角質(zhì)化細胞是毛發(fā)周期性色素形成的基礎(chǔ)［3－4］。然而，毛囊黑色素譜系細胞的這種周期性功能并不能一直良好地維持下去，隨著年齡的增長，會逐漸出現(xiàn)不可逆的毛發(fā)變白。

在關(guān)于衰老機制的研究中，人們發(fā)現(xiàn)許多組織器官如骨、骨骼肌、血管等的衰老性變化都與經(jīng)典Wnt-β-catenin 信號通路的變化相關(guān)［5－7］。前期研究也提示β-catenin能促進毛囊黑素譜系細胞的分化［5－7］，其周期性的特征性的表達變化可能是毛發(fā)周期性色素生成的重要基礎(chǔ)。據(jù)此推測在正常老年機體的皮膚組織出現(xiàn)了經(jīng)典Wnt-β-catenin信號通路的改變，從而影響了毛囊黑素譜系細胞的周期性行為，導(dǎo)致毛發(fā)色素形成的障礙。

本研究初步探討毛囊β-catenin在皮膚毛囊中衰老相關(guān)性變化，為進一步探討經(jīng)典Wnt-β-catenin信號通路與衰老相關(guān)性白發(fā)的關(guān)系提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

采用SPF級C57雄性小鼠［第三軍醫(yī)大學(xué)動物所，合格證號:SYXK(2007-0002)］。取出生后23 d，出生后35 d，出生后34個月C57雄性小鼠各12只，共36只。麻醉后貼皮剪短背毛后脫頸椎法處死，取其背部皮膚。出生后23 d的小鼠背皮均一地處于毛發(fā)第一周期靜止期，其背皮所取樣本在本文中用P23表示，代表年輕小鼠靜止期樣本。出生后35 d的小鼠背皮均一地處于毛發(fā)第2周期生長期，其背皮所取樣本在本文中用P35表示，代表年輕小鼠生長期樣本。出生后34個月小鼠背部皮膚毛發(fā)周期不同步，有區(qū)域性差異(圖1)，皮色為黑色區(qū)域為處于生長期的皮膚，所取樣本在本研究中用34MA表示，代表老年小鼠生長期樣本。皮色為淡粉色區(qū)域為處于靜止期的皮膚，所取樣本在本研究中用34MT表示，代表老年小鼠靜止期樣本。所取背部皮膚標本分為3個部分:1)4%多聚甲醛4℃固定12 h備用于石蠟包埋切片;2)－80℃保存?zhèn)溆糜诘鞍滋崛?3)保存于液氮罐中備用于RNA提取。

圖1 34月齡C57小鼠毛發(fā)與皮膚肉眼觀察大體情況Fig 1 Hair and skin appearance of 34 months old C57 mouse 3

1.2 方法

1.2.1 RT-PCR方法檢測比較老齡鼠、年輕鼠皮膚中β-catenin mRNA在毛囊周期中的表達:取 P23、P35、出生后34個月C57雄性小鼠生長期區(qū)域皮膚和靜止期區(qū)域皮膚組織各100 mg左右，DEPC水清洗組織3遍。采用 Trizol、氯仿/異丙醇法進行總RNA的提取。分光光度儀中檢測RNA純度及濃度。根據(jù)Genebank中CD1小鼠β-catenin序列，利用Primer Premier5.0軟件設(shè)計引物，同時以看家基因GAPDH作為內(nèi)參，序列如下:β-catenin上游引物為5'-ATCACTGAGCCTGCCATCTG-3'，下游引物為5'-GTTGCCACGCCTTCATTCC-3'，產(chǎn)物長度為581 bp GAPDH上游引物:5'-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3'，下游引物:5'-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3'，產(chǎn)物長度450 bp。按反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明進行反轉(zhuǎn)錄后PCR。PCR產(chǎn)物點樣于1%瓊脂糖凝膠中電泳，在凝膠成像系統(tǒng)中檢測結(jié)果并照相，使用Quantity one軟件對圖像進行分析計算，測定各條帶的吸光度值，以β-catenin條帶吸光度值/GAPDH條帶吸光度值表示β-catenin mRNA相對表達強度。

1.2.2 Western blot方法檢測比較老齡鼠、年輕鼠皮膚中 β-catenin蛋白在毛囊周期中的表達:取P23、P35、出生后34個月C57雄性小鼠生長期區(qū)域皮膚和靜止期區(qū)域皮膚組織各100 mg左右，液氮中研磨提取總蛋白。BCA法測蛋白濃度。常規(guī)Western blot操作。一抗:小鼠抗小鼠β-catenin單克隆一抗，空白對照用小鼠抗小鼠GAPDH單克隆一抗。HRP化學(xué)發(fā)光法顯色。獲得圖像后用Quantity one軟件對圖像進行分析計算，測定各條帶吸光度值，以β-catenin條帶吸光度值/GAPDH條帶吸光度值表示β-catenin蛋白相對表達強度。

1.2.3 石蠟包埋切片，IF檢測比較老齡鼠、年輕鼠皮膚毛囊中β-catenin蛋白在毛囊周期中的表達:取P23、P35、出生后34個月C57雄性小鼠生長期區(qū)域皮膚和靜止期區(qū)域皮膚組織修剪為約8 mm×5 mm長方形皮片，石蠟切片。常規(guī)免疫熒光操作。一抗:小鼠抗小鼠β-catenin單克隆一抗，另以PBS代替一抗做空白對照。二抗:Cy3標記山羊抗小鼠IgG抗體。熒光顯微鏡下觀察并照相。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

用Quantity One采集RT-PCR與WB圖片條帶吸光度，用SPSS10.0對數(shù)據(jù)作單因素方差分析，最后相對表達量用均數(shù)±標準差(±s)表示。

2 結(jié)果

2.1 RT-PCR檢測皮膚β-catenin mRNA在毛囊周期中的表達

C57小鼠背皮的β-catenin mRNA的表達由強到弱的順序為 34MA、P35、34MT、P23?？梢?β-catenin mRNA在老齡鼠生長期的表達強于在年輕鼠生長期的表達。在老齡鼠靜止期的表達也強于在年輕鼠靜止期的表達。(P＜0.05)(圖2，表1)。

圖2 β-catenin mRNA在小鼠毛囊周期中的表達Fig 2 β-catenin mRNA expression in hair cycle in mice skin

2.2 Western blot檢測皮膚β-catenin蛋白在毛囊周期中的表達

C57小鼠背皮的β-catenin蛋白的表達由強到弱的順序為 34MA、P35、34MT、P23?？梢?β-catenin蛋白在老齡鼠生長期的表達強于在年輕鼠生長期的表達。在老齡鼠靜止期的表達也強于在年輕鼠靜止期的表達(圖3)。上述表達變化的趨勢與RT-PCR檢測的結(jié)果一致的(P＜0.05)(表1)。

圖3 β-catenin蛋白在小鼠毛囊周期中的表達Fig 3 β-catenin protein expression in hair cycle in mice skin

表1 β-catenin mRNA和蛋白在小鼠毛囊周期中表達的相對吸光度值比較Table 1 Relative optical density of β-catanin mRNA and protein expression(±s，n=12)

表1 β-catenin mRNA和蛋白在小鼠毛囊周期中表達的相對吸光度值比較Table 1 Relative optical density of β-catanin mRNA and protein expression(±s，n=12)

*P＜0.05 compared with 34MT;#P＜0.05 compared with 34MA.

age mRNA expression protein expression 34MT 0.4189±0.0537 0.6348±0.0241 P23 0.1235±0.0326* 0.4243±0.0378*34MA 1.0753±0.0278 0.9024±0.0167 P35 0.9204±0.0219# 0.8012±0.0184#

2.3 IF檢測比較β-catenin蛋白在年輕小鼠和老齡小鼠毛囊中的表達

通過IF檢測比較β-catenin蛋白(紅色熒光)在老齡和年輕小鼠毛囊中的表達情況:在P23和P35的小鼠皮膚，均未見β-catenin蛋白的明顯表達;出生后34月齡小鼠的靜止期皮膚，β-catenin在毛囊的外根鞘和Bulge都有表達，尤其是在外根鞘上段的細胞表達明顯，膜、質(zhì)、核均有表達，在毛球部未見β-catenin的明顯表達。出生后34月齡小鼠的生長期皮膚，β-catenin在毛囊的外根鞘、Bulge表達明顯，胞膜、胞質(zhì)、胞核均有表達，其中外根鞘上段的細胞表達較強，在毛球部未見β-catenin的明顯表達(圖4)。

3 討論

圖4 IF檢測β-catenin蛋白在毛囊周期中的組織學(xué)分布Fig 4 β-catenin protein distribution in hair follicles tested by IF(β-catenin red，×100)

白發(fā)是人和哺乳動物衰老的一個明顯體征，了解其形成的原因?qū)θ藗兝斫馑ダ系臋C制，治療衰老相關(guān)性疾病提供一些理論基礎(chǔ)。年輕機體正常的毛囊中，黑色素譜系細胞周期性的激活、分化、增殖、遷移、合成及遞呈黑色素給角質(zhì)化細胞是毛發(fā)周期性色素形成的基礎(chǔ)［8］。隨著年齡的增長，這一過程中某些環(huán)節(jié)的障礙可能是衰老性白發(fā)產(chǎn)生的原因?；谝延械挠嘘P(guān)衰老的研究中，許多證據(jù)提示衰老與經(jīng)典 Wnt-β-catenin 信號通路的變化相關(guān)［5，7，9］，并且前期研究也指明β-catenin能促進毛囊黑素譜系細胞的分化，其周期性的表達變化可能是毛發(fā)周期性色素生成的重要基礎(chǔ)［10－11］，據(jù)此推測在正常老年機體的皮膚組織有經(jīng)典Wnt-β-catenin信號通路的改變，從而影響了毛囊黑素譜系細胞的周期性行為，導(dǎo)致毛發(fā)色素形成的障礙。

研究C57年輕鼠和鼠齡34個月的老年鼠，檢測比較了皮膚毛囊的β-catenin mRNA、蛋白質(zhì)表達水平、蛋白表達在毛囊中的組織學(xué)分布3個方面的差異。不論是在mRNA水平，還是在蛋白質(zhì)水平，相較于處于同一毛囊周期階段的年輕鼠皮膚，老年鼠背皮的β-catenin表達均有上調(diào)。但老年小鼠毛囊β-catenin的表達在靜止期和生長期都是增強的，且集中在外根鞘和Bulge細胞，也可以觀察到β-catenin的入核現(xiàn)象，此提示在老齡小鼠毛囊中，β-catenin表達的周期性發(fā)生改變，使得MSC的周期性激活與靜息節(jié)律喪失，毛囊黑色素譜系細胞的周期性分化與色素生成不能實現(xiàn)。從表達部位上看，在老齡小鼠的毛囊中，β-catenin的表達不論在靜止期或生長期，都集中于外根鞘上段和Bulge，均有入核表現(xiàn)，在外根鞘下段與毛基質(zhì)未見明顯表達，這與年輕小鼠有明顯不同［12］，提示老齡鼠毛囊中 β-catenin表達時間和部位的變化可能影響黑色素譜系細胞正常的分化及分化過程中的遷移導(dǎo)致毛發(fā)周期性色素生成障礙。綜上，在老齡小鼠毛囊中，β-catenin表達量上調(diào)，周期節(jié)律不明顯，表達部位有變化可能是衰老相關(guān)性白發(fā)產(chǎn)生的原因之一。

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