周東方，魏 峰，周俊英

(河北醫(yī)科大學第三醫(yī)院感染科，河北石家莊 050051)

酒精性肝病(alcoholic liver disease，ALD)是長期大量飲酒所致的肝臟損害性病變，其病理改變包括酒精性脂肪肝、酒精性脂肪性肝炎、酒精性肝纖維化及酒精性肝硬化［1］。ALD發(fā)病過程中存在脂質(zhì)代謝紊亂，脂肪在肝臟堆積［2］。腺苷酸激活蛋白激酶(AMP-activated protein kinase，AMPK)被稱為細胞的“代謝感受器”，參與多種代謝過程［3］。本研究擬通過觀察AMPK及其相關(guān)下游激酶在肝臟中的表達情況，探討AMPK在ALD發(fā)病過程的意義。

1 材料與方法

1.1 材料

清潔級雄性Wistar大鼠，體質(zhì)量200±20 g(由河北醫(yī)科大學動物實驗中心提供，合格證號708020)。AMPK-α2羊多克隆抗體(Santa Cruz生物技術(shù)有限公司);乙酰輔酶A羧化酶(Acetyl-CoA carboxylase，ACC)兔多克隆抗體(Abcam生物技術(shù)有限公司);固醇調(diào)節(jié)原件結(jié)合蛋白(sterol regulatory element-binding proteins，SREBP)1c兔多克隆抗體(北京博奧森生物技術(shù)有限公司);Taq DNA聚合酶(北京天根生物科技有限公司);AMV反轉(zhuǎn)錄酶(Promega公司);AMPK、ACC、SREBP、β-actin引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 動物模型的建立及分組:隨機分出10只為正常對照組，其余動物采用逐漸增加乙醇濃度和劑量的方法每日上午9時灌胃(乙醇濃度30% ～60%，劑量5～9 g/kg)，分別于 4、8、12和16 周末禁食12 h后股動脈放血處死動物10、9、8和8只，分離血清低溫保存，新鮮肝組織冰凍切片;取部分肝臟左葉以10%中性甲醛固定;另取肝組織立即－80℃冰凍備檢［4］。

1.2.2 檢測指標:1)生化指標:測定肝功能ALT、AST、CHE 及血脂 TG、TC、HDL、LDL、VLDL 水平，應(yīng)用OLYMPUS AU-600全自動生化分析儀檢測。2)病理學檢查:新鮮肝組織冰凍切片行蘇丹Ⅳ染色，余肝組織標本常規(guī)蘇木素-伊紅染色，光鏡下觀察肝組織普通病理變化。3)免疫組織化學染色法:采用PV法檢測AMPK-α2、ACC及SREBP-1c蛋白表達。肝組織蠟塊以3 μm厚度連續(xù)切片，常規(guī)脫蠟至水，進行抗原修復，滴加一抗，4℃冰箱過夜，陰性染色用PBS代替一抗，滴加辣根酶標記的二抗，置于37℃溫箱孵育30 min，光鏡下DAB顯色;蘇木精復染，0.1%鹽酸分化，氨水返藍，常規(guī)脫水，透明，中性樹膠封片。一抗工作濃度:AMPK-α2:1∶100;ACC:1∶80;SREBP － 1c:1∶100。在光鏡下按染色程度(0～3分為陰性著色、淡黃色、淺褐色、深褐色)、陽性范圍進行評分(1～4分為0% ～25%、26% ～50%、51% ～75%、76% ～100%)，最后將分數(shù)相加。4)RT-PCR法:測定AMPK、ACC及SREBP mRNA的表達(表1)。

1.3 統(tǒng)計學分析

用SPSS13.0統(tǒng)計軟件分析實驗數(shù)據(jù)，進行多組間方差分析，以均數(shù)±標準差(±s)表示。相關(guān)性分析用Pearson直線相關(guān)分析法。

表1 AMPK、ACC及SREBP的引物序列及反應(yīng)條件Table 1 The primers sequence and reactive conditions of AMPK、ACC and SREBP

2 結(jié)果

2.1 血清學指標的變化

各且與正常對照組比較，隨著造模時間的延長，ALT和AST水平逐漸升高，CHE水平逐漸降低(P＜0.05，P＜0.01)(圖1);TG、TC和LDL水平逐漸升高，HDL水平逐漸降低(P＜0.05或P＜0.01)(圖2)。

圖1 大鼠血清ALT、AST及CHE的測定結(jié)果Fig 1 Serum level of ALT、AST and CHE of the rats

2.2 肝組織病理

各實驗組肝組織脂肪變性明顯，肝小葉內(nèi)出現(xiàn)炎性壞死灶，至模型16周組大鼠肝細胞呈彌漫性小泡性脂肪變性，竇周纖維化，匯管區(qū)纖維組織增生并有纖維間隔形成(圖3)。

圖2 大鼠血清TG、TC、LDL、VLDL and HDL的測定結(jié)果Fig 2 Serum TG、TC、LDL、VLDL and HDL of the rats

2.3 免疫組織化學染色

隨著造模時間的延長AMPK-α2陽性表達逐漸減弱，主要表達于肝細胞胞質(zhì)內(nèi) (圖4);ACC陽性表達逐漸增強，主要表達于肝細胞胞質(zhì)內(nèi) (圖5);SREBP陽性表達逐漸增強，主要表達于肝細炎性壞死灶，至模型16周組大鼠肝細胞呈彌漫性小泡性脂肪變性，竇周纖維化，匯管區(qū)纖維組織增生并胞胞質(zhì)或胞核內(nèi)。與正常對照組比較(P＜0.05)(圖6，7)。

圖3 大鼠肝組織HE染色Fig 3 The liver tissue of rats(HE×400)

圖6 大鼠肝組織SREBP-1c的表達Fig 6 SREBP-1c expression of the rat liver(immunohisto-chemical staining×400)

圖7 免疫組織化學法檢測大鼠肝組織AMPK、ACC、SREBP的表達Fig 7 AMPK、ACC and SREBP of the rat liver by immunohisto－chemical method

2.4 RT-PCR

隨著造模時間延長，AMPK mRNA表達量逐漸減少;隨著造模時間的延長，ACC、SREBP mRNA的表達逐漸增加。與正常對照組比較P＜0.05(圖8，9)。肝組織中 AMPK的相對表達量與 ACC及SREBP的相對表達量均呈負相關(guān)(P＜0.01)。

3 討論

本研究顯示應(yīng)用乙醇灌胃的方法可以成功制備大鼠ALD模型，該模型肝臟病變?nèi)缰咀冃?、炎性反?yīng)和纖維化等可以反映臨床ALD的基本病變［5］。病理染色顯示隨著血清TG、TC、LDL、VLDL逐漸升高，HDL逐漸降低，肝組織脂肪變性逐漸加重，提示乙醇灌胃可以造成大鼠脂質(zhì)代謝紊亂。喂食乙醇1周后大鼠肝小葉Ⅲ帶出現(xiàn)氧含量減少。肝組織缺氧的最早損害主要是通過中斷線粒體呼吸鏈的遞氫環(huán)節(jié)導致線粒體的供能障礙，使ATP減少和耗盡、氧自由基大量形成和脂肪酸氧化受阻，造成脂肪沉積于肝細胞，形成脂肪肝［6］。

圖8 RT-PCR法檢測大鼠肝組織AMPK、ACC、SREBP mRNA/β-actin mRNA的表達Fig 8 AMPK、ACC、SREBP mRNA/β-actin mRNA expression of the rat liver with the RT-PCR method

圖9 RT－PCR檢測大鼠肝組織 AMPK、ACC、SREBP mRNA的表達Fig 9 AMPK、ACC and SREBP mRNA of the rat liver by RT－PCR

AMPK存在于線粒體內(nèi)，屬于絲/蘇氨酸蛋白激酶家族成員，由α、β和γ 3個亞單位組成，α亞單位是AMPK的主要催化部位，其中α2主要分布于肝臟、骨骼肌和心臟。AMPK的活性主要受細胞中AMP/ATP比值的調(diào)節(jié)，AMPK發(fā)生磷酸化并激活其下游的多種靶分子，當AMP/ATP比值升高或降低分別調(diào)節(jié)分解代謝和合成代謝。ACC存在于胞質(zhì)中，是脂肪酸合成的限速酶，同時又是AMPK的下游靶分子，AMPK能磷酸化ACC的79位點蘇氨酸而使其失活［7］。SREBP是一類位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和核被膜上的膜連接蛋白，是參與脂肪合成基因的主要轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，主要在肝臟和脂肪細胞表達，AMPK抑制SREBP靶基因的表達，同時ACC又是SREBP的靶基因，因此AMPK可能在調(diào)節(jié)脂肪酸和膽固醇代謝中發(fā)揮著重要作用，其作用機制為通過激活AMPK，促進 ACC發(fā)生磷酸化而失活，并減少SREBP的表達，下調(diào)其靶基因在肝細胞內(nèi)的表達，從而抑制肝內(nèi)的脂肪合成過程，進一步降低脂肪在肝臟中過度沉積所引起的脂毒性［8－9］。采用免疫組織化學染色發(fā)現(xiàn)SREBP-1c陽性著色由胞質(zhì)轉(zhuǎn)移至胞核，可能是由于 SREBP裂解激活蛋白，將SREBP-1c從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)護送到高爾基復合體，從而進行裂解，經(jīng)過2步裂解后，SREBP-1c片段從膜上游離出來，進入細胞核與固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合，調(diào)節(jié)脂代謝相關(guān)酶基因的轉(zhuǎn)錄。

本研究顯示，隨著造模時間的延長，肝組織病變加重，肝組織AMPK表達減少而ACC和SREBP的表達逐漸增加，且與AMPK呈現(xiàn)明顯的負相關(guān)性，提示ALD發(fā)病過程中AMPK表達減少，對ACC、SREBP活化的抑制作用減弱，導致脂質(zhì)合成增多，氧化分解減少，造成脂肪堆積，參與ALD發(fā)病機制的“第一次打擊”，可能是造成肝臟損傷的重要因素之一。

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