王鳳玫，王長(zhǎng)楠，宋巖峰*

(1.南京軍區(qū)福州總醫(yī)院婦產(chǎn)科，福建福州350025;2.第二軍醫(yī)大學(xué)生理教研室，上海 200433)

盆底器官功能障礙性疾病(pelvic floor dysfunction，PFD)是嚴(yán)重危害中老年婦女健康的一大疾病，主要包括盆底器官脫垂和尿失禁。研究表明，尿失禁與盆底器官脫垂具有相似的發(fā)病機(jī)制，是多因素作用的結(jié)果。女性生殖系統(tǒng)由盆底肌、韌帶、骨性骨盆所支撐。生殖泌尿系統(tǒng)機(jī)能的完整性和穩(wěn)定性有賴于完整的、功能性的膠原蛋白纖維，這些纖維對(duì)于膀胱頸、尿道和盆底器官的穩(wěn)定性具有重要作用?；|(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)是參與降解包括骨在內(nèi)的全身各種組織細(xì)胞外基質(zhì)的蛋白酶家族，包括基質(zhì)中以及整合于質(zhì)膜中的各種膠原酶和彈性蛋白酶等。研究表明，膠原蛋白降解的增加與盆底器官功能障礙性疾病有關(guān)。多數(shù)研究對(duì)象為尿失禁患者宮頸或?qū)m骶韌帶中金屬蛋白酶的表達(dá)情況［1－2］，主要以基質(zhì)金屬蛋白酶-1(matrix metalloproteinases-1，MMP-1)為主，但 MMP-2亦可降解Ⅲ型膠原蛋白。本研究觀察盆底器官脫垂患者陰道前壁組織中MMP-1、MMP-2的表達(dá)，探討基質(zhì)金屬蛋白酶與女性盆底障礙性疾病(PFD)的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)對(duì)象及分組

在獲得知情同意后，選擇2008年8月至2010年5月就診南京軍區(qū)福州總醫(yī)院的Ⅱ°以上(POP-Q評(píng)分)盆底器官脫垂(pelvic organ prolapse，POP)需要手術(shù)治療的患者20例作為POP組，手術(shù)方式為保留或不保留子宮的全盆底重建術(shù);以及同期因?qū)m頸上皮內(nèi)瘤變行全子宮切除但無SUI或盆腔臟器脫垂患者20例作為對(duì)照組。所選病例近3個(gè)月內(nèi)均未服用雌激素類藥物，無生殖道和尿道的急性感染。各組患者均無類風(fēng)濕類關(guān)節(jié)炎、甲亢等影響膠原代謝的疾病。兩組患者在年齡、產(chǎn)次、體重指數(shù)及絕經(jīng)時(shí)間等方面無顯著性差異。脫垂組患者的平均年齡為(56.3±3.1)歲，對(duì)照組患者平均年齡為(58.1±3.4)歲。脫垂組與對(duì)照組患者的體重指數(shù)、產(chǎn)次以及絕經(jīng)時(shí)間分別為:(20.9±2.4)/(21.4±2.4)kg/m2，(2.3±1.8)/(2.6±1.4)次，(7.8±3.2)/(7.1±4.2)年。

1.2 組織提取

對(duì)照組和POP組采用開腹子宮切除術(shù)和全盆底重建術(shù)，術(shù)中提取患者陰道前壁12點(diǎn)鐘處組織(1 cm×1 cm)放入標(biāo)記的容器中，置－80℃低溫保存。

1.3 MMP-1.2 mRNA的表達(dá)

按Trizol試劑盒說明提取組織總RNA，取上述RNA樣品1.5 μg進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，反應(yīng)體系為20 μL，反應(yīng)條件為37℃ 1 h，95℃ 5 min。取產(chǎn)物5 μL進(jìn)行PCR擴(kuò)增，MMP-1.2分別與內(nèi)參照基因GAPDH的引物共管擴(kuò)增。MMP-1的引物序列為:5'-GGAGCCCTGATGTTTCCC-3'及5'-ATGCGATTAC TACAGATACTGT-3';MMP-2引物為:5'-GCGGATCC AGCGCCCAGAGAGACAC-3'及5'-TTAAGCTTCCAC TCCGGGCAGGATT-3';GAPDH引物序列為:5'-TG TCTCCTGTGACTTCAACAGC-3'及5'-TGATGGTATT CGAGAGAA GGG-3';MMP-1.2及GAPDH預(yù)計(jì)擴(kuò)增片段分別為346、646及326 bp。MMP-1反應(yīng)條件為:94℃ 30 s，55℃ 45 s，72℃ 50 s，30個(gè)循環(huán)后，72℃延伸10 min。MMP-2 PCR參數(shù)為94℃ 60 s，55℃ 30 s，72℃ 60 s。30個(gè)循環(huán)后，72℃延伸5 min。通過凝膠圖像吸光度分析系統(tǒng)對(duì)PCR產(chǎn)物電泳條帶進(jìn)行灰度掃描，計(jì)算MMP-1.2與GAPDH吸光度值的比值作為MMP-1.2 mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

1.4 組織MMP-1.2活性分析

標(biāo)本于液氮下粉碎、勻漿、離心，取上清液，以Centricon濃縮柱按體積比離心濃縮6倍，BioRad蛋白定量試劑盒(北京賽馳生物科技有限公司)定量、分裝。取20 μL上清液進(jìn)行聚丙烯酰胺(SDS)凝膠電泳，濃縮膠濃度50 g/L(pH 6.8)，分離膠濃度100 g/L(pH 8.8)。電泳后，凝膠于50 mmol/L Tris-HCl(pH 7.0)、5 mmol/L CaCl2、100 mmol/L NaCl、0.1%Triton X-100中浸泡振搖1 h，中間換液1次，不含Triton X-100的洗液洗5 min后，再用50 mmol/L Tris-HCl(pH 7.5)、5 mmol/L CaCl2、200 mmol/L NaCl、0.2 g/L NaN3、10 mL/L Triton X-100 的孵育液37℃條件下孵育18～24 h，考馬斯亮藍(lán)R250染色，脫色，干燥封膠。通過凝膠圖像吸光度分析系統(tǒng)對(duì)結(jié)果進(jìn)行灰度掃描，以平均吸光度(INT)和雜交信號(hào)面積(S)的乘積代表信號(hào)強(qiáng)度。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，組間用t檢驗(yàn)。檢測(cè)結(jié)果均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示。

2 結(jié)果

2.1 兩組患者陰道前壁組織MMP-1.2 mRNA的表達(dá)

脫垂患者陰道前壁組織中MMP-1 mRNA的表達(dá)明顯高于對(duì)照組(P＜0.01)(圖1，2)。

2.3 兩組患者陰道前壁組織金屬蛋白酶的表達(dá)

脫垂組患者陰道組織上清液中，活性形式MMP-1(42 ku)的表達(dá)明顯高于對(duì)照組(P＜0.05)。而活性形式的MMP-2(62 ku)表達(dá)無差別，但脫垂患者陰道壁組織中MMP-2酶原(72 ku)卻呈現(xiàn)高表達(dá)(P＜0.05)(圖3，4)

3 討論

隨著人口老齡化和對(duì)生活質(zhì)量要求的提高，盆底功能障礙性疾病的發(fā)病率有增高的趨勢(shì)。據(jù)統(tǒng)計(jì)，60歲以上婦女的患病率可高達(dá)50%。目前很多研究認(rèn)為，POP發(fā)生與盆底支持組織結(jié)構(gòu)功能完整性的破壞密切相關(guān)，以機(jī)械性損傷如陰道分娩、陰道難產(chǎn)等引起的盆底肌肉、韌帶及筋膜的破壞為主。但有一些無陰道分娩的患者也會(huì)發(fā)生盆底器官脫垂，而且在大部分脫垂患者中，脫垂是在分娩數(shù)年后才發(fā)生。因此認(rèn)為除了機(jī)械性損傷外，還有其他參與機(jī)制。年老或絕經(jīng)患者宮骶韌帶的彈性明顯降低，膠原蛋白代謝明顯增強(qiáng)，進(jìn)一步引起盆底肌肉及韌帶功能減弱，這些機(jī)制是受金屬蛋白酶控制［3］。膠原蛋白的異常代謝，膠原蛋白含量的減少、成分比例的改變以及金屬蛋白酶表達(dá)的增加均與壓力性尿失禁和盆底器官脫垂有關(guān)。壓力性尿失禁患者陰道壁組織中 MMP-1的表達(dá)明顯增強(qiáng)，而其抑制物TIMP-1的表達(dá)明顯降低［1］。而壓力性尿失禁與盆底器官脫垂具有相似的發(fā)病機(jī)制，那么盆底器官脫垂患者的陰道壁組織中MMP-1的表達(dá)是否也具有相似的趨勢(shì)呢?本研究檢測(cè)了MMP-1的mRNA表達(dá)，對(duì)其活性進(jìn)行分析。結(jié)果表明，盆底器官脫垂患者陰道壁中MMP-1 mRNA的表達(dá)明顯增加，酶活性分析顯示結(jié)果與基因表達(dá)相一致。MMP-1活性增加的原因可能是因?yàn)榛虮磉_(dá)和酶原合成增加有關(guān)。機(jī)體內(nèi)生物酶發(fā)揮作用的同時(shí)亦有抑制物發(fā)揮著抑制酶活性作用。那么在脫垂患者中MMP-1酶活性抑制作用是否同時(shí)有所減弱，有待我們進(jìn)一步去研究。

除了基質(zhì)金屬蛋白酶-1(MMP-1)外，研究表明，盆內(nèi)筋膜中基質(zhì)金屬蛋白酶-2(MMP-2)與盆底功能障礙性疾病的關(guān)系較密切。但有報(bào)道POP患者宮骶韌帶中MMP-2的表達(dá)與對(duì)照組對(duì)比無明顯差別［4］，POP患者宮骶韌帶中MMP-2的表達(dá)與對(duì)照組對(duì)比明顯升高［5］。作者認(rèn)為可能此結(jié)果可能是由于入選患者的絕經(jīng)狀態(tài)影響，因?yàn)樾约に乜梢杂绊懡饘俚鞍酌傅幕钚?。作為與子宮關(guān)系密切的陰道頂端，脫垂患者中明膠酶的表達(dá)是否與宮骶韌帶一致。為了排除性激素的影響，本研究選取的患者均為絕經(jīng)后。研究表明與參考文獻(xiàn)［4］研究結(jié)果相一致，POP患者陰道壁中MMP-2的表達(dá)與對(duì)照組對(duì)比無明顯差別。但有趣的是，在本研究中發(fā)現(xiàn)POP患者陰道前壁中MMP-2的前體pro-MMP-2的表達(dá)卻明顯增加，此現(xiàn)象的發(fā)生需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究。

以上研究表明，基質(zhì)金屬蛋白酶-1(MMP-1)通過降解膠原蛋白在生殖器官脫垂中發(fā)揮著重要作用，但MMP-1的高表達(dá)是否是脫垂發(fā)生的原因，仍需進(jìn)一步研究證實(shí)。

［1］Chen Y，Desautel M，Anderson A，et al.Collagen synthesis is not altered in women with stress urinary incontinence［J］.Neurourol Urodyn，2004，23:367－373.

［2］Liapis A，Bakas P，Pafiti A，et al.Changes in the quantity of collagen typeⅠin women with genuine stress incontinence［J］.Urol Res，2000，28:323 －326.

［3］Reay Jones NH，Healy JC，King LJ，et al.Pelvic connective tissue resilience decreases with vaginal delivery，menopause and uterine prolapse［J］.Br J Surg，2003，90:466－472.

［4］Tomislav S，Marko V，Snjezana T，et al.Matrix metalloproteinases-1，-2 expression in uterosacralligaments from women with pelvic organ prolapse［J］.Marturitas，2009，64:132－135.