曹一鑫，馮 新，王建力，陳 莉

(1.南通大學(xué)附屬醫(yī)院皮膚科，江蘇南通226001;2.海門市皮膚病防治醫(yī)院;3.南通大學(xué)醫(yī)學(xué)院病理學(xué)系，江蘇南通 226001)

隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)的發(fā)展，從基因水平上探索防治皮膚鱗癌的新途徑已日益成為國內(nèi)外研究的熱點(diǎn)，其中RNA干擾(RNA interference，RNAi)技術(shù)是目前最有希望攻克腫瘤的方法之一［1－2］，將為皮膚鱗癌未來的臨床治療開辟一個新的領(lǐng)域。本研究擬通過RNAi技術(shù)沉默人皮膚鱗癌細(xì)胞系(A431細(xì)胞)中VEGF基因，觀察癌細(xì)胞增殖、遷移和黏附的改變，為進(jìn)一步開發(fā)以VEGF基因為靶點(diǎn)的皮膚鱗癌基因治療提供實(shí)驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

人皮膚鱗癌細(xì)胞(A431)由西安第四軍醫(yī)大學(xué)附屬西京醫(yī)院高天文教授惠贈。PCR Maker(Tiangen公司);脂質(zhì)體(Invitrogen公司)，DMEM培養(yǎng)基及胎牛血清(Gibco公司)，PCR試劑盒、DNA連接試劑盒、分子質(zhì)量標(biāo)記和限制性內(nèi)切酶(寶生物工程有限公司)。EILSA試劑盒、FN、鼠抗VEGF單克隆抗體和羊抗鼠IgG抗體(Santa Cruz公司)，CCK-8(日本同仁公司)，Transwell小室(Coastar公司)。

1.2 方法

1.2.1 質(zhì)粒構(gòu)建:利用Qiagen siRNA設(shè)計軟件，根據(jù)基因庫中的VEGF序列設(shè)計2個靶位點(diǎn)的VEGF shRNA序列(55 nt的寡核苷酸)［3］。通過真核表達(dá)載體pSilencer4.1-CMVneo構(gòu)建靶向VEGF基因的shRNA表達(dá)載體(psilencer-VEGF-shRNA，VEGF-s1和VEGF-s2)。同法構(gòu)建與人類任何基因序列均無同源關(guān)系的隨機(jī)靶序列作為陰性對照表達(dá)質(zhì)粒(Target-off-shRNA，T-off)，設(shè)計質(zhì)粒序列見表1。

1.2.2 實(shí)驗方法:取對數(shù)生長期細(xì)胞接種于100 mL培養(yǎng)瓶中，待細(xì)胞生長至90% ～95%匯合時，參照試劑盒說明書進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染。設(shè)未轉(zhuǎn)染的A431細(xì)胞為對照組(N)。1)實(shí)時熒光定量反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(real-time qutant RT-PCR，RT-QPCR)檢測A431細(xì)胞中VEGF mRNA的表達(dá)，VEGF引物序列:上游:5'-ATGCGGATCAAACCTCACCA-3'，下游:5'-TTACACGTCTGCGGATCTTG-3'，內(nèi)參GAPDH引物序列:5'-CGAAGTCAACGGTGGTCGTAT-3'，下游:5'-AGCCTTCTCGGT GGTGAAGAC-3'，反應(yīng)條件:95℃7 min，95 ℃ 變性20 s，55 ℃ 退火30 s，72 ℃ 延伸30 s，45個循環(huán)，最后72℃延伸7 min。2)ELISA檢測A431細(xì)胞中VEGF分泌蛋白的表達(dá)。3)Western blot檢測A431細(xì)胞中VEGF蛋白的表達(dá)。選擇450 nm波長，在酶標(biāo)儀上測定各孔吸光度(A)值。4)流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期，細(xì)胞增殖指數(shù)(Proliferation Index，PI)=(S+G2/M)/(G0/G1+S+G2/M)。5)細(xì)胞劃痕法檢測細(xì)胞二維空間遷移情況，在倒置顯微鏡(×100)下分別測量每組細(xì)胞在0、24、48和72 h通過劃痕區(qū)的長度占劃痕區(qū)總長度的百分比代表其相對遷移率。6)Transwell小室試驗細(xì)胞三維空間遷移情況，遷移細(xì)胞用結(jié)晶紫染色，在倒置顯微鏡下分別計數(shù)5個視野，取其均值。7)細(xì)胞黏附實(shí)驗中0.02%結(jié)晶紫染色，酶聯(lián)免疫儀上測定各孔570 nm A值。黏附率(%)=［(實(shí)驗組細(xì)胞A值/BSA組細(xì)胞A值)－1］×100%。上述實(shí)驗中每組3個復(fù)孔，實(shí)驗重復(fù)3次。

表1 shRNA真核表達(dá)質(zhì)粒的序列Table 1 Sequences of shRNA

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

用SPSS14.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差以(±s)表示，進(jìn)行方差齊性檢驗與方差分析。配對計量資料采用配對t檢驗。率的比較用χ2檢驗。

2 結(jié)果

2.1 沉默VEGF后A431細(xì)胞中VEGF mRNA和蛋白的表達(dá)

轉(zhuǎn)染VEGF-s1，VEGF-s2的細(xì)胞中VEGF mRNA和蛋白表達(dá)量較N組顯著減少(P＜0.05)，VEGF-s1與VEGF-s2組間以及轉(zhuǎn)染T-off組與N組間均無差異(圖1)。

2.2 沉默VEGF對A431細(xì)胞增殖的影響

2.2.1 CCK-8法檢測轉(zhuǎn)染各組A431細(xì)胞的增殖:轉(zhuǎn)染后 24、48、72 和96 h，VEGF-S1，VEGF-S2 兩組與N組相比細(xì)胞增殖能力顯著下降(P＜0.05)。轉(zhuǎn)染VEGF-S1，VEGF-S2兩組間以及轉(zhuǎn)染T-off組與N組間均無差異(圖2)。

2.2.2 流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果:與N組相比，轉(zhuǎn)染VEGF-s1和VEGF-s2組細(xì)胞阻滯于G1期，S期細(xì)胞數(shù)顯著減少，細(xì)胞增殖指數(shù)明顯減小(P＜0.001);轉(zhuǎn)染VEGF-s1和VEGF-s2組間以及轉(zhuǎn)染T-off組與 N組組間均無差異。轉(zhuǎn)染 VEGF-s1，VEGF-s2的細(xì)胞出現(xiàn)有意義凋亡峰(12%和11.28%)顯著高于轉(zhuǎn)染 T-off組(0.91%)(P＜0.05)，N組未出現(xiàn)凋亡峰(圖3)。

2.3 沉默VEGF對A431細(xì)胞遷移的影響

2.3.1 劃痕實(shí)驗:顯示轉(zhuǎn)染VEGF-s1和VEGF-s2兩組相對遷移率明顯比N組小(均P＜0.05)，其他時間點(diǎn)各組間均無顯著差異(圖4)。

2.3.2 Transwell小室檢測結(jié)果:顯示轉(zhuǎn)染VEGF-s1和VEGF-s2兩組細(xì)胞穿膜數(shù)(111±29和103±16)明顯少于N組(332±10)(P＜0.05)，而VEGF-s1與VEGF-s2組間以及N組與轉(zhuǎn)染T-off組(290±12)組間均無顯著差異(圖5)。

2.4 沉默VEGF對A431細(xì)胞黏附的影響

細(xì)胞黏附的結(jié)果:顯示轉(zhuǎn)染VEGF-s1和VEGF-s2兩組細(xì)胞黏附率(15.06%±0.28%和16.70%±0.65%)明顯比 N組(39.60% ±0.92%)低(P＜0.01)。VEGF-s1與 VEGF-s2組間及 N組與 T-off組(36.02% ±5.02%)間均無顯著差別(圖6)。

3 討論

本研究通過RNAi技術(shù)抑制皮膚鱗癌A431細(xì)胞中VEGF表達(dá)，研究VEGF對癌細(xì)胞增殖、遷移和黏附的作用。研究結(jié)果顯示，本研究設(shè)計與構(gòu)建的靶向VEGF的shRNA(VEGF-s1，VEGF-s2)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染A431細(xì)胞后能顯著抑制細(xì)胞內(nèi)VEGF mRNA和VEGF蛋白的表達(dá)。通過靶向VEGF的RNAi技術(shù)處理A431細(xì)胞后細(xì)胞增殖能力明顯下降，發(fā)生G1期細(xì)胞周期阻滯，并使細(xì)胞調(diào)亡增加，進(jìn)一步抑制了細(xì)胞遷移和黏附。該結(jié)果提示，VEGF與A431細(xì)胞增生、凋亡、遷移、黏附存在著密切關(guān)系。研究結(jié)果證明，本文構(gòu)建的靶向VEGF的RNAi質(zhì)粒具有較好的靶向性和高效性，為今后進(jìn)一步在皮膚鱗癌中靶向VEGF的抑癌研究提供了基礎(chǔ)。

［1］Wang S，Liu H ，Ren L，et al.Inhibiting colorectal carcinoma growth and metastasia by blocking the expression of VEGF using RNA interference ［J］.Neoplasia，2008，10:399－407.

［2］Takei Y，Kadomatsu K，Yuzawa Y，et al.A small interfering RNA targeting vasculator endothelial growth factor as cancer therapeutics［J］.Cancer Res，2004，64:3365 －3370.

［3］荊春霞，張洹.VEGF siRNA的篩選、評價及siRNA的設(shè)計規(guī)則探討［J］.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床，2006，126:579 －585.