馬姝琛，嚴(yán)海東，莊守綱，蘭 洋，張瑞青，王 奕

(同濟(jì)大學(xué)附屬東方醫(yī)院腎內(nèi)科，上海 200120)

隨著終末期腎衰竭發(fā)病率的升高，臨床上腹膜透析的運用越來越多。而隨著透析齡的增加，腹膜透析的重要合并癥腹膜失超濾的發(fā)生率也隨之增加。已知腹膜間皮細(xì)胞在保持腹膜的正常結(jié)構(gòu)和功能中起主要作用。為了探討腹膜間皮細(xì)胞在腹膜失超濾中的作用，有必要建立一種簡便有效的方法獲取腹膜間皮細(xì)胞，本實驗為在體外進(jìn)行腹膜間皮細(xì)胞及腹膜的研究提供了有效手段。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 取材 雄性SD大鼠(體質(zhì)量:120～160 g，由上海交通大學(xué)附屬瑞金醫(yī)院實驗動物中心提供)無菌手術(shù)取得的大網(wǎng)膜及脾胃韌帶。

1.1.2 主要儀器設(shè)備 超凈臺、吸管、離心管、0.22 μm濾膜過濾器、手術(shù)剪、眼科剪、鑷子、培養(yǎng)皿、25 cm2培養(yǎng)瓶、普通離心機(jī)、CO2培養(yǎng)箱、倒置相差顯微鏡等。

1.1.3 主要試劑 磷酸鹽緩沖液(PBS)、DMEM/F12培養(yǎng)液(加入青鏈霉素各100 μ/ml)、胎牛血清(FCS)、完全培養(yǎng)液(含15%FCS的DMEM/F12培養(yǎng)液)、細(xì)胞消化液(0.25% 胰蛋白酶 0.02%EDTA)、免疫熒光抗體(抗細(xì)胞角蛋白抗體)、免疫組化染色抗體(抗波形蛋白抗體、抗白細(xì)胞CD45抗體、抗第Ⅷ因子相關(guān)抗原抗體)

1.2 方法

1.2.1 RPMC的分離培養(yǎng) 無菌取得SD大鼠大網(wǎng)膜及脾胃韌帶，置于培養(yǎng)皿內(nèi)，PBS液洗3次。加入細(xì)胞消化液，置于37℃培養(yǎng)箱中消化約10 min。取出后加入等量完全培養(yǎng)液終止消化，吸管吹打約10 min。液體移入10 ml尖底離心管中，1000 r/min，離心5 min。棄上清。加入適量完全培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，裝于25 cm2培養(yǎng)瓶中。放置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。

1.2.2 RPMC的傳代培養(yǎng) 消化下的RPMC置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，根據(jù)細(xì)胞貼壁情況24～48 h后予以首次換液。此后，每2～3 d換液一次。約5～8 d細(xì)胞生長融合，開始首次傳代。PBS洗1次，加入細(xì)胞消化液約1 ml，鏡下觀察細(xì)胞消化情況，待細(xì)胞變圓脫落后，加入2 ml完全培養(yǎng)液終止消化，并適當(dāng)吹打，液體移入10 ml尖底離心管內(nèi)。1 000 r/min，離心5 min。棄上清，加入適量完全培養(yǎng)液重懸細(xì)胞。分裝于25 cm2培養(yǎng)瓶中，繼續(xù)置于培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。

1.2.3 鑒定 取第2代RPMC置光鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，染色并計算純度。鑒定:免疫熒光鑒定:細(xì)胞爬片經(jīng)95%冷乙醇固定后，用抗細(xì)胞角蛋白熒光抗體染色;免疫組化鑒定:細(xì)胞爬片經(jīng)95%冷乙醇固定后，分別用抗波形蛋白抗體、抗白細(xì)胞CD45抗體、抗第Ⅷ因子相關(guān)抗原抗體，行細(xì)胞免疫組化染色(圖1～4)。

2 結(jié) 果

本實驗結(jié)果顯示從大網(wǎng)膜等消化而來的RPMC在光鏡下呈葡萄串狀。細(xì)胞培養(yǎng)約8 h即可開始貼壁生長，細(xì)胞呈多形性(梭形、橢圓形、多角形)，邊緣不整，呈拉網(wǎng)狀生長。以后細(xì)胞生長融合呈多角形，大小較一致，整體似鋪路石外觀。細(xì)胞免疫熒光染色提示細(xì)胞角蛋白抗原陽性，細(xì)胞免疫組化染色分析提示波形蛋白抗原陽性，白細(xì)胞CD45抗原、抗第Ⅷ因子相關(guān)抗原陰性。故可排除成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、白細(xì)胞，可證實本實驗分離培養(yǎng)所得為腹膜間皮細(xì)胞。

3 討 論

為提高RPMC分離培養(yǎng)的成功率需注意:①無菌操作非常重要。新鮮獲取的組織最好及時處理。如不能馬上處理，需浸泡于含青鏈霉素的PBS液中，盡量在24 h內(nèi)使用。②嚴(yán)格掌握消化時間。時間過短會導(dǎo)致未能消化下所需細(xì)胞，時間過長會影響細(xì)胞的活性，細(xì)胞存活率明顯下降，如消化時間超過30 min，則成纖維細(xì)胞的出現(xiàn)率將大于50%。③一般培養(yǎng)6～8 h即可開始貼壁，如仍未貼壁，則一般貼壁生長可能性明顯降低，但一般初次換液仍將在培養(yǎng)24～48 h后進(jìn)行，換液前盡量減少晃動以免影響其貼壁。④傳代超過3次細(xì)胞可出現(xiàn)老化、形態(tài)異常。故實驗最好采用前三代細(xì)胞。

目前PMC的分離培養(yǎng)方法較多，據(jù)文獻(xiàn)介紹有直接將胰酶等注入腹腔消化獲取消化液進(jìn)行培養(yǎng)［1-2］，或從腹透流出液中分離、培養(yǎng)［3］，有將剪取的網(wǎng)膜組織直接接種于培養(yǎng)瓶中的直接消化法［4］，膠原酶消化法［5］等，因?qū)嶒災(zāi)康牟煌?，各種方法都被采用，但都存在一定局限性，如細(xì)胞獲取率較低，費時、費力，對儀器有特殊要求，培養(yǎng)周期長，費用昂貴等，而且人腹膜的獲取還存在倫理問題。

本實驗采用的是大鼠的網(wǎng)膜，采用胰酶消化法，用時短，重復(fù)性好，費用相對低廉，總之，可操作性強。為體外研究PMC的生理功能及其在腹膜炎、腹膜纖維化等防治中的作用提供了必要的、很好的物質(zhì)基礎(chǔ)。

［1］樊敏，劉伏友，段紹斌，等.改良法培養(yǎng)鼠腹膜間皮細(xì)胞［J］.湖南醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2002，27(6):542－544.

［2］徐家云，樊小軍，常潔，等.幾丁糖對高糖腹透液刺激大鼠腹膜間皮細(xì)胞TGF-β1表達(dá)的影響［J］.第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報，2010，32(13):1446 －1448.

［3］周循，凌光輝，鄒莎琳，等.腹膜透析流出液中人腹膜間皮細(xì)胞的培養(yǎng)及轉(zhuǎn)分化特征［J］.中國現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志，2010，20(17):2634 －2642.

［4］石永兵，金東華，詹周兵，等.人腹膜間皮細(xì)胞的原代培養(yǎng)及傳代［J］.蘇州大學(xué)學(xué)報:醫(yī)學(xué)版，2010，30(2):307－309.

［5］董柯，陳香美，傅博，等.高糖和抗生素對大鼠腹膜間皮細(xì)胞表達(dá) PAI和 TGF-β mRNA的影響［J］.中華內(nèi)科雜志，1997，10(36):689 －692.