李天然，雷 勇，宋 斌，田嘉禾

1.南京軍區(qū)福州總醫(yī)院第一附屬醫(yī)院放射科，福建莆田351100;2.解放軍總醫(yī)院核醫(yī)學(xué)科

分子影像技術(shù)不但能夠診斷肝癌及其轉(zhuǎn)移灶，也能夠預(yù)測肝癌轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)。經(jīng)過3年的研究［1］表明，利用FDG PET能夠反映肝癌的代謝活性這一能力，通過與臨床病例的比較分析，得出FDG PET能夠預(yù)測肝癌的侵襲性，預(yù)測腫瘤的預(yù)后及評估對治療的反應(yīng)。葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(glucose transporters，Glut)是腫瘤組織FDG攝取的關(guān)鍵因子，肝癌腫瘤細(xì)胞的增殖活性與葡萄糖代謝呈正相關(guān)，與Glut1的表達(dá)呈正相關(guān)，但與腫瘤血管化程度無明確相關(guān)性［2］。體外肝癌腫瘤模型也證實(shí) FDG PET攝取 SUV與 Glut1的表達(dá)呈正相關(guān)［3］。

然而，針對具有不同轉(zhuǎn)移潛能的肝癌FDG攝取情況與葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的關(guān)系的研究尚未見到，因此本研究針對具有高低轉(zhuǎn)移潛能的肝癌細(xì)胞進(jìn)行FDG攝取研究，并檢測 Glut1和Glut3表達(dá)水平，分析其相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器、試劑和細(xì)胞株

1.1.1 儀器:水浴鍋，XMTD-6000型，北京長風(fēng)儀器儀表公司;水套式5%CO2培養(yǎng)箱，3100型，美國Thermo Scientific Forma公司;倒置顯微鏡，江南 XD-101型，南京江南永新光學(xué)有限公司;超凈臺，BCL-1360B型，北京亞泰科隆實(shí)驗(yàn)科技開發(fā)中心;井型通用閃爍探頭II(井型 γ-計(jì)數(shù)儀，F(xiàn)J-367型，國營267廠);酒精燈、移液管、普通顯微鏡、血球計(jì)數(shù)板、試管、吸管等。

1.1.2 試劑:高糖 DMEM，PAA Laboratories GmbH(Austria);10%胎牛血清，F(xiàn)BS-07-003，Bio international Limited(Newzeland);0.1%胰蛋白酶 +EDTA，Biological Industries(Austria);PBS液，PAA Laboratories GmbH(Austria);18F-FDG，解放軍總醫(yī)院正電子藥物放化實(shí)驗(yàn)室提供。

1.1.3 肝癌細(xì)胞株:高轉(zhuǎn)移細(xì)胞株 MHCC97-H，低轉(zhuǎn)移細(xì)胞株MHCC97-L，實(shí)驗(yàn)用細(xì)胞株購自上海復(fù)旦大學(xué)肝癌研究所。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 常規(guī)腫瘤細(xì)胞培養(yǎng):兩種細(xì)胞對血清純度要求高，傳代密度低，細(xì)胞生長至85%左右，胰酶消化、傳代。

1.2.2 肝癌細(xì)胞FDG結(jié)合實(shí)驗(yàn):① 將接種24 h細(xì)胞取出，倒置顯微鏡下觀察六孔板中細(xì)胞狀態(tài)。②配制示蹤劑:取示蹤劑18F-FDG 500 ～1 000 μCi，用 PBS 液稀釋，PBS液用量根據(jù)計(jì)數(shù)進(jìn)行調(diào)整，取稀釋后示蹤劑液500 μL加入小試管中，置入井型γ-計(jì)數(shù)儀中計(jì)數(shù)，使計(jì)數(shù)穩(wěn)定在800 000～100 000。③向六孔板各孔中加入調(diào)整后示蹤劑500 μL，置入5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng);并向一空白管中加入同樣劑量示蹤劑作為空白對照，置入井型 γ-計(jì)數(shù)儀中計(jì)數(shù)、記錄。④ 30、60、90、120、150、180 min依次取出六孔板，取一孔，去上清液，用PBS液沖洗3次，加入胰酶0.5 mL，孵育3 min，用DMEM培養(yǎng)液1 mL中和，吹打，將細(xì)胞懸濁液移至小試管中，并用PBS液沖洗孔一并移至小試管中，置入井型γ-計(jì)數(shù)儀中計(jì)數(shù)、記錄。同時(shí)測量空白管 γ-計(jì)數(shù)、記錄。⑤γ-計(jì)數(shù)完成后，選取其中3～6孔試管中細(xì)胞計(jì)數(shù)，取平均數(shù)作為該批次細(xì)胞計(jì)數(shù)值。

1.2.3 肝癌細(xì)胞FDG流出率與吸收率測量實(shí)驗(yàn):①將接種24 h細(xì)胞取出，倒置顯微鏡下觀察六孔板中細(xì)胞狀態(tài)。② 配制示蹤劑:取示蹤劑FDG 500～1 000 μCi，用PBS液稀釋，PBS液用量根據(jù)計(jì)數(shù)進(jìn)行調(diào)整，取稀釋后示蹤劑液500 μL加入小試管中，置入井型γ-計(jì)數(shù)儀中計(jì)數(shù)，使計(jì)數(shù)穩(wěn)定在100 000以下。③向六孔板各孔中加入示蹤劑500 μL，置入5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng);并向一空白管中加入同樣劑量示蹤劑，置入井型γ-計(jì)數(shù)儀中計(jì)數(shù)、記錄。④示蹤劑與細(xì)胞共同孵育60 min后所有孔取上清液，用PBS液沖洗3次，每孔加入 PBS液 3 mL，再次放入 5%CO2培養(yǎng)箱中。⑤ 30、60、90、120、150、180 min 依次取出六孔板，取一孔，去上清液，用PBS液沖洗3次，加入胰酶0.5 mL，孵育3 min，用DMEM培養(yǎng)液1 mL中和，吹打，將細(xì)胞懸濁液移至小試管中，并用PBS液沖洗孔一并移至小試管中，置入井型γ-計(jì)數(shù)儀中計(jì)數(shù)、記錄。同時(shí)測量空白管γ-計(jì)數(shù)、記錄。⑥γ-計(jì)數(shù)完成后，選取其中3～6孔試管中細(xì)胞計(jì)數(shù)。

1.2.4 兩株細(xì)胞 Glut1、Glut3的 Western blot法檢測實(shí)驗(yàn)方法:① 蛋白樣品制備主要包括:細(xì)胞裂解，Glut1、Glut3蛋白提取。② BAC(Bradford)法蛋白濃度測定:按照BCA蛋白定量試劑盒(博邁德)使用說明操作，測定蛋白濃度，標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出蛋白濃度。③電泳:分離膠及濃縮膠配制、待測樣品準(zhǔn)備(蛋白變性)、上樣電泳，待溴酚藍(lán)電泳至膠底部時(shí)終止電泳。④轉(zhuǎn)膜:PVDF膜及濾紙轉(zhuǎn)膜緩沖液中浸透，使用大連競邁生物科技有限公司ST-II型半干式轉(zhuǎn)膜儀轉(zhuǎn)膜，轉(zhuǎn)膜約45～90 min，5%脫脂奶粉封閉1 h。一抗孵育、二抗孵育按說明書進(jìn)行。⑤顯色、曝光:DAB顯色試劑盒(ZLI-9032，北京中杉)顯色，ECL化學(xué)發(fā)光顯色液(普利萊)曝光。⑥圖像處理:將顯色后的膜或底片照相，并用LabWorks軟件對圖像進(jìn)行灰度分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 將結(jié)果細(xì)胞數(shù)統(tǒng)一調(diào)整至×105，放射性衰變調(diào)整采用同一時(shí)間實(shí)驗(yàn)計(jì)數(shù)與空白管計(jì)數(shù)之比計(jì)算得出。細(xì)胞攝取率(或流出率)計(jì)算:%/105=實(shí)驗(yàn)計(jì)數(shù)/空白管計(jì)數(shù) ×100%/細(xì)胞計(jì)數(shù)。采用SPSS 17.0軟件包處理數(shù)據(jù)，進(jìn)行t檢驗(yàn)及相關(guān)分析。P＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 高低轉(zhuǎn)移潛能肝癌細(xì)胞與FDG結(jié)合實(shí)驗(yàn)結(jié)果MHCC97-H細(xì)胞截止180 min平均攝取率為0.248±0.049(%/105，下同)，MHCC97-L 細(xì)胞截止 180 min攝取率為0.249±0.068，兩種細(xì)胞FDG攝取率比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。各個(gè)時(shí)間點(diǎn)兩種細(xì)胞FDG攝取率比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。從趨勢上看，隨著時(shí)間的延長，兩組細(xì)胞FDG攝取率呈逐漸升高的趨勢，高轉(zhuǎn)移潛能與低轉(zhuǎn)移潛能肝癌細(xì)胞對FDG攝取率相近，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，F(xiàn)DG不能區(qū)分高低轉(zhuǎn)移潛能肝癌細(xì)胞(見圖1)。

2.2 不同轉(zhuǎn)移潛能肝癌細(xì)胞FDG流出率與吸收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果 FDG與細(xì)胞共同孵育60 min后去上清，PBS洗脫FDG 3次，加入PBS共同孵育。不同時(shí)間點(diǎn)測得FDG流出率與吸收率，觀察兩種細(xì)胞培養(yǎng)皿中PBS內(nèi)FDG流出率和留存細(xì)胞內(nèi)的吸收率，計(jì)算120 min肝癌細(xì)胞吸收率和流出率。高低轉(zhuǎn)移潛能細(xì)胞流出率、吸收率比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);高轉(zhuǎn)移肝癌細(xì)胞(MHCC97-H)吸收率與流出率呈正相關(guān)(r=0.599，P ＜0.05)。低轉(zhuǎn)移肝癌細(xì)胞(MHCC97-L)吸收率和流出率相關(guān)性檢驗(yàn)結(jié)果表明，吸收率與流出率呈正相關(guān)(r=0.787，P ＜0.05，見圖 2、3)。

2.3 不同轉(zhuǎn)移潛能肝癌細(xì)胞FDG攝取率與葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白-3(Glut3)、葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白-1(Glut1)相關(guān)性檢驗(yàn)分析

2.3.1 兩株肝癌細(xì)胞Glut3、Glut1免疫印跡法(Western blot)檢測結(jié)果:對電泳條帶圖利用LabWorks軟件進(jìn)行灰度值(IOD)半定量分析，兩株細(xì)胞Glut3、Glut1表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。低轉(zhuǎn)移肝癌細(xì)胞(MHCC97-L)Glut3表達(dá)高于Glut1表達(dá)。高轉(zhuǎn)移肝癌細(xì)胞Glut1和Glut3表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05，見圖4)。

圖4 高低轉(zhuǎn)移潛能肝癌細(xì)胞Glut1和Glut3表達(dá)情況比較 A:電泳圖;B:MHCC97-H;C:MHCC97-LFig 4 Glut1 and Glut3 expression of high and low metastatic potential hepatocellular carcinoma cells A:electrophoresis map;B:MHCC97-H;C:MHCC97-L

2.3.2 高低轉(zhuǎn)移潛能肝癌細(xì)胞與Glut1和Glut3表達(dá) 之間的相關(guān)分析:采用Pearson相關(guān)檢驗(yàn)結(jié)果顯示，Glut1與MHCC97-H FDG攝取率呈明顯正相關(guān)(r=0.960，P ＜0.05)，Glut3 與 MHCC97-H FDG 攝取率呈正相關(guān)(r=0.612，P ＜0.05)，Glut1 與 MHCC97-L FDG攝取率呈正相關(guān)(r=0.546，P ＜0.05)，Glut3 與 MHCC97-L FDG攝取率無明顯的相關(guān)性(r=0.462，P＞0.05，見圖 5)。

圖5 葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(Glut)與高低肝癌細(xì)胞FDG攝取率之間相關(guān)分析 A:Glut1與MHCC97-H FDG攝取率相關(guān)性分析;B:Glut3與MHCC97-H FDG攝取率相關(guān)性分析;C:Glut1與MHCC97-L FDG攝取率相關(guān)性分析;D:Glut3與MHCC97-L FDG攝取率相關(guān)性分析Fig 5 Correlation analysis of glucose transporter(Glut)and the HCC cells FDG uptake rate A:Correlation analysis of Glut1 and MHCC97-H FDG uptake rate;B:Correlation analysis of Glut3 and MHCC97-H FDG uptake rate;C:Correlation analysis of Glut1and MHCC97-L FDG uptake rate;D:Correlation analysis of Glut3 and MHCC97-L FDG uptake rate

3 討論

肝癌的FDG PET研究一直是熱點(diǎn)，這主要是HCC對FDG的攝取有其特殊性［4］，葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白被認(rèn)為是細(xì)胞FDG攝取的關(guān)鍵因子，尤其是Glut1，已經(jīng)證實(shí)［5-6］，Glut1表達(dá)高低與肝癌的分級及與FDG的攝取具有正相關(guān)性，然而關(guān)于具有不同轉(zhuǎn)移潛能的肝癌細(xì)胞攝取FDG的情況以及與葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白關(guān)系的研究尚未見到，肝癌的轉(zhuǎn)移特性是影響預(yù)后的關(guān)鍵因素，能夠早期預(yù)測肝癌的轉(zhuǎn)移潛能具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。因此，本研究就是針對具有不同轉(zhuǎn)移潛能的肝癌細(xì)胞FDG攝取特性與葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)分析，觀察能否早期預(yù)測肝癌的轉(zhuǎn)移行為。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，F(xiàn)DG的原始劑量作用時(shí)間的不同是前后兩組實(shí)驗(yàn)出現(xiàn)差異的原因。原始劑量作用時(shí)間足夠長的情況下(第一組實(shí)驗(yàn)180 min)，不同轉(zhuǎn)移潛能肝癌細(xì)胞FDG攝取率趨同，不能做出有效的區(qū)分，而在FDG原始劑量作用時(shí)間較短的情況下(第二組實(shí)驗(yàn)60 min)，不同轉(zhuǎn)移潛能肝癌細(xì)胞FDG攝取存在差異，可以做出有益的區(qū)分。利用三房室四參數(shù)模型理論解釋FDG注射到人體后在肝臟組織中的代謝過程［7］，在原始示蹤劑劑量足夠大、作用時(shí)間足夠長的情況下，細(xì)胞對FDG的攝取存在著飽和現(xiàn)象，致使FDG攝取率趨同，或差異較小而不能區(qū)分。FDG細(xì)胞內(nèi)外的運(yùn)動是客觀存在的。傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為FDG進(jìn)入腫瘤細(xì)胞后，在己糖激酶(HK)同工酶的催化下變成18F-2-脫氧葡萄糖6-磷酸，由于在18F-2-G-6-P的C-2位上沒有氧原子，所以不易被葡萄糖6-磷酸酶降解，同時(shí)18F-2-G-6-P也不受葡萄糖-6-磷酸脫氫酶的作用，因此18F-2-G-6-P被陷留在腫瘤細(xì)胞內(nèi)，構(gòu)成了FDG腫瘤顯像的生物學(xué)基礎(chǔ)［8］。然而，本研究結(jié)果顯示，同一細(xì)胞內(nèi)外的FDG運(yùn)動是客觀存在的，且存在著明顯的相關(guān)性，具有不同轉(zhuǎn)移潛能的肝癌細(xì)胞FDG細(xì)胞內(nèi)外運(yùn)動情況不同，可能的原因在于具有不同轉(zhuǎn)移潛能的肝癌細(xì)胞內(nèi)各種酶的差異所致，本研究沒有對酶學(xué)進(jìn)行測定，運(yùn)動到細(xì)胞外液的FDG可能是還未進(jìn)行磷酸化的FDG分子或重新生成的FDG分子，有研究確認(rèn)在高分化原發(fā)性肝癌，細(xì)胞內(nèi)存在較高水平的葡萄糖-6-磷酸酶，能將存在于細(xì)胞內(nèi)的6-磷酸-18FFDG水解成18F-FDG，后者通過自由擴(kuò)散游離出細(xì)胞［9］。此外，還涉及到FDG的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)方式，除了由葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白介導(dǎo)的協(xié)同擴(kuò)散之外是否還有自由擴(kuò)散這種方式存在，需要進(jìn)一步研究。

FDG的細(xì)胞運(yùn)動需要葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，本組實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，在高轉(zhuǎn)移潛能肝癌細(xì)胞Glut1和Glut3含量表達(dá)兩者無差異，而在低轉(zhuǎn)移潛能肝癌細(xì)胞兩者存在差異，高低轉(zhuǎn)移潛能肝癌細(xì)胞間Glut1和Glut3含量表達(dá)無差異。由此可見，Glut1和Glut3不是高低轉(zhuǎn)移潛能差異的關(guān)鍵因素。葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白與FDG攝取率之間相關(guān)性檢驗(yàn)結(jié)果表明，Glut1和Glut3與高轉(zhuǎn)移潛能細(xì)胞FDG攝取率存在著明顯的正相關(guān)，而低轉(zhuǎn)移潛能肝癌細(xì)胞與Glut1存在正相關(guān)，與Glut3無明顯相關(guān)性。這些結(jié)果表明，Glut1和Glut3對肝癌細(xì)胞攝取FDG具有重要意義，但兩種蛋白作用能力不同，Glut1對兩株細(xì)胞均具有價(jià)值，而Glut3對高轉(zhuǎn)移潛能肝癌細(xì)胞價(jià)值較大，對低轉(zhuǎn)移潛能肝癌細(xì)胞價(jià)值較小。由此可見，Glut1和Glut3肝癌細(xì)胞的表達(dá)是細(xì)胞特性表現(xiàn)，而Glut1和Glut3介導(dǎo)下的肝癌細(xì)胞的FDG攝取情況說明Glut1和Glut3功能上的差異。Glut1是最主要的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體類型，Glut3轉(zhuǎn)運(yùn)體的特征是低Km值，即在葡萄糖濃度比較低的情況下，Glut3的轉(zhuǎn)運(yùn)效率比其他的轉(zhuǎn)運(yùn)體要高［10］。本研究中FDG攝取率測定中FDG是飽和的，所以在此主要是Glut1起作用。

因此，F(xiàn)DG原始劑量作用時(shí)間是導(dǎo)致高低轉(zhuǎn)移潛能肝癌細(xì)胞攝取FDG差異的原因。Glut1和Glut3不是高低轉(zhuǎn)移潛能差異的因素。在原始劑量飽和狀態(tài)下Glut1發(fā)揮主要介導(dǎo)肝癌細(xì)胞FDG攝取。葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白與FDG攝取率之間存在著不同的相關(guān)性，是兩株細(xì)胞內(nèi)在差異的具體體現(xiàn)。

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