李海芳， 孫 鵬， 迪麗努爾·沙比托夫， 楊玲玲， 閆明俞， 劉君康

(新疆維吾爾自治區(qū)食品藥品檢驗(yàn)所，新疆烏魯木齊830004)

蘇合香丸是著名的溫通開竅藥，被《中國(guó)藥典》收錄，現(xiàn)代臨床多用于中風(fēng)所致的神志不清、牙關(guān)緊閉、半身不遂重癥，至今仍是搶救煤氣中毒和心肌梗塞、心絞痛的有效藥物。該藥處方中含有朱砂礦物藥材，由于歷史原因，該藥基礎(chǔ)研究薄弱，隨著中藥安全性問題日益引起重視，朱砂的毒性問題也引起了國(guó)內(nèi)外廣泛的關(guān)注［1-2］。因此，本實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了大鼠口服蘇合香丸10 d后對(duì)其肝腎功能的影響及汞蓄積情況的研究。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 wistar大鼠，(150±30)g，雄性，清潔級(jí)。購(gòu)于新疆醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物許可證號(hào)SCXK(新)2003-0001。

1.2 試藥 蘇合香丸(批號(hào):JB65001、8010079、9010464、9010171)大蜜丸3 g/丸;朱砂細(xì)粉(本所藥材標(biāo)本室提供)。

制備方法:取一丸蘇合香丸剪碎后，用5%羧甲基纖維素鈉溶液30 mL溶解，使用拍打式無(wú)菌均質(zhì)器拍打180 s，制備成0.1 g/mL的混懸液;精密稱取朱砂細(xì)粉105 mg，加入5%羧甲基纖維素鈉溶液30 mL，制備成3.5 mg/mL的混懸液。每天臨用現(xiàn)配。

1.3 試劑 硝酸(優(yōu)級(jí)純，批號(hào)20100508，北京化工廠);硫酸(優(yōu)級(jí)純，批號(hào)20100508，北京化工廠);鹽酸(優(yōu)級(jí)純，批號(hào)100325，西安化學(xué)試劑廠);硼氫化鉀(優(yōu)級(jí)純，批號(hào)20100617，天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所);氫氧化鉀(分析純，批號(hào)20070720，天津市福晨化學(xué)試劑廠);重鉻酸鉀(分析純，批號(hào)20030407，天津市化學(xué)試劑三廠)。

1.4 標(biāo)準(zhǔn)品 汞單元素標(biāo)準(zhǔn)溶液(GBW 086178094，標(biāo)準(zhǔn)值1000 μg/mL，中國(guó)計(jì)量科學(xué)研究院);魚肉中的總汞與甲基汞含量標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)［GBW 100290801，總汞標(biāo)準(zhǔn)值(0.85±0.03)mg/kg，甲基汞標(biāo)準(zhǔn)值(0.84 ±0.03)mg/kg，中國(guó)計(jì)量科學(xué)研究院］。

1.5 儀器 組織勻漿機(jī)(D-130，WIGGEN HAUSER);低溫冰箱(型號(hào)MDF-U333，三洋醫(yī)用生物電子有限公司);低溫高速離心機(jī)(SIGMA3K15型，德國(guó)SIGMA公司);電子天平(BP221S，北京賽多利斯天平有限公司);拍打式無(wú)菌均質(zhì)器(BD-400，南京貝帝實(shí)驗(yàn)儀器有限公司);雙道原子熒光光度計(jì)(AFS-830a，北京吉天儀器有限公司)。智能電熱消解儀(型號(hào)LabTach，萊伯泰科公司)。

2 實(shí)驗(yàn)方法和檢測(cè)指標(biāo)

2.1 試驗(yàn)分組 wistar大鼠，60只，隨機(jī)分為6組，即陰性組、蘇合香丸Ⅰ組、Ⅱ組、Ⅲ組、Ⅳ組、朱砂組。陰性組灌胃給予等容量的5%羧甲基纖維素鈉溶液;蘇合香丸Ⅰ組(批號(hào)8010079)、Ⅱ組(批號(hào)9010464)、Ⅲ組(批號(hào) 9010171)、Ⅳ組(批號(hào)JB65001)、朱砂組分別灌胃給予相應(yīng)組的供試液0.5 mL/100 g。每天一次，連續(xù)灌胃10 d。

2.2 檢測(cè)指標(biāo)

2.2.1 肝腎功能相關(guān)血生化指標(biāo)檢驗(yàn) 最后一次給藥后，所有大鼠禁食不禁水18 h，稱量體質(zhì)量后，25%烏拉坦溶液(0.4 mL/100 g)腹腔注射進(jìn)行麻醉，腹主動(dòng)脈取血離心制備血清進(jìn)行谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶、血清胱抑素、尿素氮、肌酐的檢驗(yàn)。同時(shí)小心剝?nèi)〈笫蟾闻K及腎臟并稱質(zhì)量，計(jì)算臟器系數(shù)。

2.2.2 組織病理學(xué)檢查 右腎及剩余肝臟組織浸泡于10%甲醛溶液中備用進(jìn)行組織病理學(xué)檢查。

2.2.3 肝腎組織中總汞的測(cè)定 取所有大鼠的左腎及部分肝臟組織使用雙道原子熒光光度計(jì)檢測(cè)動(dòng)物組織中總汞量。

3 統(tǒng)計(jì)方法 采用SPSS 11.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

4 結(jié)果

4.1 大鼠口服蘇合香丸10 d后對(duì)體質(zhì)量的影響 大鼠口服蘇合香丸、朱砂粉10 d后的體質(zhì)量增長(zhǎng)正常，毛發(fā)光澤，經(jīng)統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)各組較陰性對(duì)照組比較無(wú)顯著性差異。見表1。

表1 大鼠口服蘇合香丸10 d后對(duì)體質(zhì)量的影響(± s，n=10)

表1 大鼠口服蘇合香丸10 d后對(duì)體質(zhì)量的影響(± s，n=10)

/g陰性組組別 初給藥體質(zhì)量/g 10 d后體質(zhì)量146.1 ±27.5 181.4 ±23.0蘇合香丸Ⅰ組 146.2 ±26.8 177.7 ±23.0蘇合香丸Ⅱ組 158.6 ±30.8 180.1 ±30.4蘇合香丸Ⅲ組 160.6 ±37.3 191.7 ±38.3蘇合香丸Ⅳ組 151.8 ±34.9 183.1 ±31.0朱砂組147.6 ±30.4 179.9 ±27.4

4.2 大鼠口服蘇合香丸10 d后對(duì)肝、腎臟器系數(shù)的影響大鼠口服蘇合香丸、朱砂粉10 d后，解剖大鼠對(duì)心、肝、脾、肺、腎等主要臟器進(jìn)行肉眼觀察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)各組均無(wú)明顯病變情況。稱量肝、腎組織的濕質(zhì)量，按體質(zhì)量折算臟器系數(shù)(臟器質(zhì)量g/100 g體質(zhì)量)，經(jīng)統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)各組大鼠臟器系數(shù)較陰性對(duì)照組比較無(wú)顯著性差異。見表2。

4.3 大鼠口服蘇合香丸10 d后對(duì)血液生化指標(biāo)的影響大鼠口服蘇合香丸、朱砂粉10d后，用25%烏拉坦溶液(0.4 mL/100 g)腹腔注射進(jìn)行麻醉，腹主動(dòng)脈取血進(jìn)行肝功能及腎功能相關(guān)血生化指標(biāo)檢驗(yàn)［3］。結(jié)果表明:朱砂組與陰性組比較肝功能及腎功能均有損傷跡象，即谷草轉(zhuǎn)氨酶、血清胱抑素、肌酐數(shù)值顯著性增高(P＜0.05);尿素氮數(shù)值與陰性組比較有顯著性降低(P＜0.05)。蘇合香丸各組肌酐數(shù)值與陰性組比較均有顯著性增高(P＜0.05，P＜0.01)，表明蘇和香丸在本實(shí)驗(yàn)條件下對(duì)腎功能有一定影響。見表3。

表2 大鼠口服蘇合香丸10 d后對(duì)大鼠肝腎臟器系數(shù)的影響(± s，n=10)

表2 大鼠口服蘇合香丸10 d后對(duì)大鼠肝腎臟器系數(shù)的影響(± s，n=10)

組別 肝臟g/(100 g體質(zhì)量)腎臟g/(100 g體質(zhì)量)2.74 ±0.23 0.63 ±0.05蘇合香丸Ⅰ組 2.77 ±0.25 0.63 ±0.05蘇合香丸Ⅱ組 2.75 ±0.26 0.65 ±0.07蘇合香丸Ⅲ組 2.68 ±0.17 0.61 ±0.06蘇合香丸Ⅳ組 2.65 ±0.13 0.63 ±0.04朱砂組陰性組2.60 ±0.17 0.61 ±0.05

表3 大鼠口服蘇合香丸10 d后對(duì)大鼠血液生化指標(biāo)的影響(± s，n=10)

表3 大鼠口服蘇合香丸10 d后對(duì)大鼠血液生化指標(biāo)的影響(± s，n=10)

注:各組與陰性組比較:*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01，＊＊＊P ＜0.001。

組別 谷丙轉(zhuǎn)氨酶ALT/(U·L－1)谷草轉(zhuǎn)氨酶AST/(U·L－1)ALT/AST 血清胱抑素/(μg·mL－1)尿素氮BUN/(mmol·L －1)肌酐Cr/(μmol·L －1)BUN/Cr陰性組 76.90 ±39.83 229.40 ±99.93 3.06 ±0.94 1.08 ±0.22 11.09 ±0.86 36.10 ±6.37 0.31 ±0.05蘇合香丸Ⅰ組 75.40 ±13.75 243.30 ±57.97 3.27 ±0.66 1.59 ±0.45 10.94 ±1.24 47.50 ±8.46* 0.24 ±0.04＊＊＊蘇合香丸Ⅱ組 72.70 ±17.99 215.80 ±43.66 3.02 ±0.45 1.39 ±0.32 11.29 ±0.90 44.50 ±4.03＊＊ 0.26 ±0.03＊＊蘇合香丸Ⅲ組 64.70 ±25.11 223.90 ±63.51 3.62 ±0.83 1.46 ±0.35 10.89 ±1.22 43.90 ±6.90＊＊ 0.25 ±0.04＊＊蘇合香丸Ⅳ組 87.30 ±27.94 270.30 ±52.64 3.22 ±0.49 1.34 ±0.16 11.15 ±0.64 44.30 ±4.27＊＊ 0.26 ±0.03＊＊朱砂組 118.10 ±45.16 298.90 ±92.29*2.64 ±0.40 1.49 ±0.19* 10.19 ±0.92* 42.90 ±4.68* 0.24 ±0.04＊＊＊

4.4 大鼠口服蘇合香丸10 d后對(duì)肝腎組織病理學(xué)的影響大鼠解剖肉眼觀察各組大鼠肝、腎均未見明顯異常。毒性病理組織形態(tài)檢查結(jié)果顯示蘇合香丸各組、朱砂組與陰性對(duì)照組相比較均未見到有關(guān)的病理改變，在本次實(shí)驗(yàn)條件下，各組均未對(duì)大鼠肝、腎造成病理性損傷。

4.5 大鼠口服蘇合香丸10 d后肝腎組織中總汞的測(cè)定［4］

4.5.1 樣品的處理方法［5］精密稱取大鼠肝臟和腎臟組織各0.5 g，分別置50 mL聚丙烯消解管中，加入硝酸∶硫酸(V/V，3∶1)4 mL，于智能電熱消解儀中120℃恒溫消解3 h，放冷，加雙氧水0.5 mL，搖勻，消解 0.5 h，取出冷卻至室溫，用5%鹽酸加至聚丙烯消解管10 mL刻度處，搖勻。取1.0 mL，轉(zhuǎn)移至刻度管中加5%鹽酸定容至10 mL，搖勻后進(jìn)行測(cè)定，同時(shí)做試劑空白。

4.5.2 大鼠肝腎組織中總汞測(cè)定方法學(xué)研究

4.5.2.1 儀器條件［6］光電倍增管負(fù)高壓270 V;燈電流(峰值)26 A;原子化器高度8 mm;載流液5%鹽酸溶液;還原劑為20 g/L KBH4+5 g/L KOH;載氣(Ar)流量300 mL/min;測(cè)量方式為標(biāo)準(zhǔn)曲線法。

4.5.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定 吸取汞標(biāo)準(zhǔn)溶液1000 μg/mL，5.0 mL于100 mL 量瓶中，用5%HNO3(含 0.5 g/L K2Cr2O7，保護(hù)Hg2+不還原成單質(zhì)汞而被玻皿吸附)溶液定容至刻度，搖勻。用5%鹽酸溶液稀釋至汞溶液質(zhì)量濃度分別為0、0.1、0.2、0.5、1.0、1.5、2.0 μg/L。按上述測(cè)定條件設(shè)置儀器參數(shù)，穩(wěn)定30 min后開始測(cè)定，記錄熒光強(qiáng)度，以質(zhì)量濃度(μg/L)為橫坐標(biāo)，熒光強(qiáng)度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。汞濃度在0～2.0 μg/L范圍內(nèi)，含量與熒光強(qiáng)度呈正相關(guān)，γ為0.9995。

4.5.2.3 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)魚肉(GBW 100290801)中的總汞回收率測(cè)定 稱取標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)魚肉9份，每份約0.2 g，精密稱定后，置50 mL聚丙烯消解管中，加入硝酸∶硫酸(V/V，3∶1)4 mL，于智能電熱消解儀中120℃恒溫消解3 h，放冷，加雙氧水0.5 mL，搖勻，消解0.5 h，取出冷卻至室溫，用純水加至聚丙烯消解管10 mL刻度處，搖勻。取1.0 mL，轉(zhuǎn)移至刻度管中加5%鹽酸定容至10 mL，搖勻后進(jìn)行測(cè)定，同時(shí)做試劑空白，測(cè)定結(jié)果均在標(biāo)準(zhǔn)值范圍內(nèi)，回收率達(dá)到要求，為0.82～0.88 mg/kg。

4.5.2.4 正常大鼠肝臟組織加標(biāo)回收率測(cè)定 正常大鼠肝臟組織勻漿后稱取12份，每份約0.5 g，精密稱定后，置50 mL聚丙烯消解管中。1～3份用于測(cè)定肝臟組織中汞的濃度;4～6份(加標(biāo) A-1～3)加入0.5 μg/mL 汞標(biāo)準(zhǔn)溶液 0.04 mL;7～9份(加標(biāo) B-1～3)加入0.5 μg/mL 汞標(biāo)準(zhǔn)溶液 0.1 mL;10～12份(加標(biāo) C-1 ～3)加入 0.5 μg/mL 汞標(biāo)準(zhǔn)溶液0.16 mL，每份加入硝酸∶硫酸(V/V，3 ∶1)4 mL，按照前述樣品處理方法進(jìn)行消解，消解液稀釋后進(jìn)行測(cè)定，同時(shí)做試劑空白，測(cè)定結(jié)果各組回收率為107% ～122%。詳見表4。

表4 正常大鼠肝臟組織中汞加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)結(jié)果

4.5.2.5 精密度及檢出限 儀器檢測(cè)精密度為3.92%。儀器檢出限為0.0045 μg/L(相關(guān)系數(shù)0.9940，n=5)。方法檢出限為0.01355 μg/L。

4.5.3 計(jì)算 肝、腎組織中含汞量，代入下列公式計(jì)算:X=(C1－C0)×V/m。式中X:樣品中汞的質(zhì)量分?jǐn)?shù)(μg/g);C1:測(cè)定樣液中汞的含有量(μg/L);C0:試劑空白中汞的含有量(μg/L);v:為樣品消解定容后總體積;m為樣品稱樣量(g)。

4.5.4 大鼠口服蘇合香丸10 d后肝、腎組織中汞測(cè)定 將消解好的樣品稀釋后進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果表明:大鼠口服蘇合香丸10 d后與陰性組比較，在肝臟和腎臟均有明顯的蓄積，且在腎臟的蓄積更為顯著。具體見表5。

表5 大鼠口服蘇合香丸10 d后肝、腎組織中含汞量(± s，n=10)

表5 大鼠口服蘇合香丸10 d后肝、腎組織中含汞量(± s，n=10)

注:各組與陰性組比較，*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01，＊＊＊P ＜0.001。

組別 肝臟中汞/(μg·g－1) 腎臟中汞/(μg·g－1)陰性組0.0944 ±0.0343 0.0644 ±0.0267蘇合香丸Ⅰ組 0.1049 ±0.0224 0.2335 ±0.0444＊＊＊蘇合香丸Ⅱ組 0.1419±0.0319＊＊＊ 0.3099±0.1166＊＊＊蘇合香丸Ⅲ組 0.1382 ±0.0357* 0.3018 ±0.1290＊＊＊蘇合香丸Ⅳ組 0.1342 ±0.0286* 0.3148 ±0.0656＊＊＊朱砂組 0.1756 ±0.0328＊＊＊ 0.3876 ±0.1090＊＊＊

4.5.5 大鼠口服蘇合香丸10 d后肝、腎中總汞蓄積率測(cè)定經(jīng)前期測(cè)定［7］，得知實(shí)驗(yàn)各批號(hào)蘇合香丸中成藥的總汞量，計(jì)算每克組織中的汞蓄積率，發(fā)現(xiàn)汞在腎臟組織蓄積高于在肝臟組織的蓄積。計(jì)算公式:每克組織中汞蓄積率(‰)=每克組織中汞量×1000/(大鼠日服用量×蘇合香丸總汞量×10)。具體結(jié)果見表6。

表6 大鼠口服蘇合香丸10 d后肝、腎中總汞蓄積率測(cè)定結(jié)果

5 討論

汞的毒性已眾所周知，以硫化汞為主要成分的朱砂的毒性也已引起人們的高度警惕和重視。但目前仍有大量的中藥成方制劑含有朱砂［8］，這些制劑多以經(jīng)典方為主，由于歷史原因，這些制劑的基礎(chǔ)研究非常薄弱。由于我國(guó)開展重金屬限量標(biāo)準(zhǔn)的研究工作較晚，目前僅對(duì)部分中藥產(chǎn)品中的Pb、Hg、As等量作了限制，對(duì)大多數(shù)中藥(包括中藥生藥、制劑、提取物)目前尚未制定和完善其限量標(biāo)準(zhǔn)［9］。我國(guó)對(duì)《中國(guó)藥典》中的朱砂劑量進(jìn)行過(guò)修訂，如1990年版及以往的歷版藥典朱砂日用劑量較大，為0.3～1.5 g，1995年版將朱砂劑量降至0.1～0.5 g，至2010年版仍為該限定劑量。2005年版《中國(guó)藥典》收錄的含朱砂的成方制劑達(dá)46個(gè)，占《中國(guó)藥典》收載制劑的8.1%;2010年版《中國(guó)藥典》收錄的含朱砂的成方制劑達(dá)54個(gè)，占《中國(guó)藥典》收載制劑的5.1%。鑒于含有朱砂的成方制劑在《中國(guó)藥典》占有相當(dāng)?shù)臄?shù)量，所涉及的制劑及其功能主治、臨床適應(yīng)癥數(shù)量、種類繁多，重新評(píng)價(jià)朱砂在成方制劑中的毒性和應(yīng)用價(jià)值的工作就凸顯出了迫切性。

蘇合香丸是含有朱砂的成方制劑，目前被《中國(guó)藥典》收錄。我們對(duì)其進(jìn)行了大鼠口服10 d的毒性評(píng)價(jià)工作。發(fā)現(xiàn)大鼠口服蘇合香丸后對(duì)其體質(zhì)量、肝腎器官臟器系數(shù)沒有影響;血生化檢驗(yàn)中未發(fā)現(xiàn)其對(duì)肝功能敏感指標(biāo)谷丙轉(zhuǎn)氨酶和谷草轉(zhuǎn)氨酶有影響，對(duì)腎功能敏感指標(biāo)血清胱抑素、尿素氮、肌酐檢驗(yàn)后發(fā)現(xiàn)服藥組肌酐數(shù)值與陰性組比較均有顯著性增高(P＜0.05)，但數(shù)值仍在正常值范圍內(nèi);病理組織形態(tài)學(xué)檢查顯示該藥品在10 d飼喂后未造成大鼠肝腎組織病理性損傷;經(jīng)雙道原子熒光光度計(jì)測(cè)定組織中的總汞，發(fā)現(xiàn)在肝腎組織中有汞蓄積現(xiàn)象，且在腎臟的蓄積率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于肝臟。

在本實(shí)驗(yàn)中選擇的大鼠灌胃劑量為臨床人用最大劑量，在該劑量下服用10 d即可顯示出肌酐數(shù)值出現(xiàn)增高趨勢(shì)。如果超劑量服用或超時(shí)服用，依據(jù)本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示可能會(huì)引起肌酐數(shù)值的進(jìn)一步增高，可能會(huì)超過(guò)正常值范圍甚至產(chǎn)生病理性損傷。

汞的靈敏度非常高，因此需要特別注意來(lái)自各方面的污染［10-11］。實(shí)驗(yàn)中用到的所有器皿必須經(jīng)過(guò)20%HNO3(V∶V)浸泡過(guò)夜，并用去離子水清洗干凈后方能使用。通常分析純?cè)噭┲锌赡軙?huì)含有少量汞，影響實(shí)驗(yàn)測(cè)定結(jié)果，尤其是鹽酸，故所有試劑應(yīng)盡可能采用優(yōu)級(jí)純，同時(shí)要作試劑空白用來(lái)扣除試劑帶來(lái)的影響。

另外，考慮到大鼠性別差異對(duì)血生化數(shù)值的影響［12］，本次研究?jī)H選擇同一性別的大鼠進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)。

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