呂 楠， 孫寶珍， 榮子丹， 陳衛(wèi)平

(1.天津市醫(yī)藥科學(xué)研究所，天津300020;2.天津中新藥業(yè)集團股份有限公司達仁堂制藥廠，天津300457)

運動性疲勞是指由機體運動本身所引起的機體生理過程不能持續(xù)其機能在一特定水平上和/或不能維持預(yù)定的運動強度的機體運動能力下降的現(xiàn)象［1］。角鯊烯是由6個異戊二烯組成的多不飽和烯烴，具有改善機體新陳代謝、增強機體免疫力和抗疲勞等幫助機體加快恢復(fù)劇烈運動后內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的作用［2］。目前尚未見到國內(nèi)有關(guān)角鯊烯上述方面的藥理學(xué)報道，因此本實驗對角鯊烯膠丸的抗運動性疲勞作用進行了深入研究。

1 實驗材料

1.1 藥品與試劑 角鯊烯:淡黃色不溶于水的油狀液體，批號20091018，天津中新藥業(yè)集團股份有限公司達仁堂制藥廠提供，實驗時以大豆油為溶劑，配制成所需的濃度。血乳酸試劑盒:批號20080706，南京建成生物工程研究所。肝糖原測定試劑盒:批號20080610，南京建成生物工程研究所。血尿素氮測試盒:批號20090630，武漢博士德生物工程有限公司。

1.2 實驗動物 昆明種小白鼠，雄性，體質(zhì)量18～22 g，6～8周齡，購自北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實驗動物科學(xué)部，許可證編號SCXK(京)2006-0008。

1.3 實驗儀器 日本Olympus Au640全自動生化分析儀;80-1型離心機，上海手術(shù)器械廠;UV-260紫外可見分光光度儀;PL203型電子精密天平(1/1000)，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;大小鼠轉(zhuǎn)棒儀，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所。

2 實驗方法

2.1 動物分組 小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)5 d后，按體質(zhì)量隨機分為對照組(大豆油)，受試物高、中、低劑量組(角鯊烯膠丸3.6、1.8、0.9 mL/kg)，共 4 組，每組 10 只。灌胃給藥，每日一次，連續(xù)7 d。給藥體積均為10 mL/kg體質(zhì)量。

2.2 小鼠應(yīng)激游泳時間的測定［3］末次給藥前，稱各組小鼠體質(zhì)量。于末次灌胃1 h后，將各組小鼠放入60 cm×30 cm×30 cm的游泳箱中，箱內(nèi)水溫控制在(12±0.5)℃。除此之外，另取10只同種小鼠，在同樣條件下，在水溫(30±0.5)℃的游泳箱中游泳，為常溫游泳對照組。各小鼠尾根部負重自身體質(zhì)量5%的鉛塊。以小鼠頭部沉入水中10 s不能浮出水面為體力耗竭，記錄小鼠自游泳開始至體力耗竭的時間作為小鼠游泳時間。

2.3 小鼠轉(zhuǎn)棒時間的測定［4］于給藥第3天起對各組小鼠進行轉(zhuǎn)棒訓(xùn)練，開始2 d轉(zhuǎn)棒速度為20 r/min，第3天為30 r/min，第4天為40 r/min。每天訓(xùn)練30 min。于末次灌胃1 h后，將各組小鼠放置在轉(zhuǎn)速為40 r/min的轉(zhuǎn)棒儀上，進行轉(zhuǎn)棒試驗。記錄各小鼠自放上轉(zhuǎn)棒儀到掉落的時間，計為轉(zhuǎn)棒時間。

2.4 小鼠游泳后血乳酸的測定［5］于末次灌胃1 h后，將各小鼠放入60 cm×30 cm×30 cm的游泳箱中，箱內(nèi)水溫控制在(30±0.5)℃。不負重游泳60 min后停止。各小鼠立即用毛細管從眼內(nèi)眥取血。休息20 min后，再次取血。按試劑盒說明書方法測血乳酸。

2.5 小鼠游泳后血清尿素氮的測定［6］于末次灌胃1 h后，將各小鼠放入60 cm×30 cm×30 cm的游泳箱中，箱內(nèi)水溫控制在(30±0.5)℃。不負重游泳90 min，休息60 min后采血，分離血清，二乙酰-肟法測定血清尿素氮。

2.6 小鼠游泳后肝糖原的測定 于末次灌胃1 h后，將各小鼠放入60 cm×30 cm×30 cm的游泳箱中，箱內(nèi)水溫控制在(30±0.5)℃。不負重游泳90 min后立即處死。取肝臟經(jīng)生理鹽水漂洗后用濾紙吸干，精確稱取肝臟100 mg，蒽酮法測定肝糖原含量。

2.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計 采用SPSS11.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，數(shù)據(jù)以±s表示，多組間樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，兩樣本均數(shù)比較采用t檢驗。

3 實驗結(jié)果

3.1 對小鼠應(yīng)激游泳時間的影響 小鼠應(yīng)激游泳后，應(yīng)激對照組與常溫游泳對照組比較有顯著差異(P＜0.001)，表明低水溫應(yīng)激負重游泳會減少小鼠的游泳時間。與應(yīng)激對照組比較，角鯊烯3.6 mL/kg劑量組和1.8 mL/kg劑量組均可顯著延長小鼠應(yīng)激游泳時間(P＜0.001;P＜0.05)，分別延長了49.51%和25.00%。提示角鯊烯膠丸對小鼠應(yīng)激狀態(tài)有顯著的拮抗作用。結(jié)果見表1。

3.2 對小鼠轉(zhuǎn)棒時間的影響 與正常對照組比較，角鯊烯3.6 mL/kg劑量組和1.8 mL/kg劑量組均可顯著延長小鼠轉(zhuǎn)棒運動時間(P＜0.001)，分別延長了210.25%和85.09%。提示角鯊烯膠丸能夠增強小鼠的運動耐力。結(jié)果見表2。

表1 角鯊烯膠丸對小鼠應(yīng)激游泳時間的影響(± s，n=10)

表1 角鯊烯膠丸對小鼠應(yīng)激游泳時間的影響(± s，n=10)

注:與應(yīng)激對照組比較，*P ＜0.05，＊＊＊P ＜0.001;與常溫對照組比較，△△△P ＜0.001。

/min常溫對照組組別 動物數(shù)/只 游泳時間10 4.36 ±0.4210 8.12 ±0.63應(yīng)激對照組 10 4.12 ±0.96△△△角鯊烯高劑量組 10 6.16 ±0.53＊＊＊角鯊烯中計量組 10 5.15 ±0.64*角鯊烯低劑量組

表2 角鯊烯膠丸對小鼠轉(zhuǎn)棒時間的影響(± s，n=10)

表2 角鯊烯膠丸對小鼠轉(zhuǎn)棒時間的影響(± s，n=10)

注:與對照組比較，＊＊＊P ＜0.001。

/min對照組組別 動物數(shù)/只 轉(zhuǎn)棒時間10 3.22 ±0.88角鯊烯高劑量組 10 9.99 ±2.47＊＊＊角鯊烯中計量組 10 5.96 ±1.06＊＊＊角鯊烯低劑量組10 3.86 ±0.68

3.3 對小鼠游泳后血乳酸的影響 與正常對照組比較，角鯊烯膠丸3.6 mL/kg劑量組明顯降低小鼠游泳后的血乳酸水平，同時也降低游泳休息20 min后的血乳酸水平，但三個劑量組對血乳酸平均清除率沒有顯著影響。結(jié)果見表3。

表3 角鯊烯膠丸對小鼠游泳后血乳酸的影響(± s，n=10)

表3 角鯊烯膠丸對小鼠游泳后血乳酸的影響(± s，n=10)

注:與對照組比較，*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01。

組別 動物數(shù)/只血乳酸/(mmol·L-1)泳后即測 泳后20 min血乳酸平均清除率/(mmol·L-1·min-1)對照組10 9.88 ±0.79 4.54 ±0.80 0.267 ±0.020角鯊烯高劑量組 10 8.75 ±0.71＊＊3.57 ±0.72*0.259 ±0.031角鯊烯中計量組 10 9.29 ±0.96 4.16 ±0.88 0.257 ±0.039角鯊烯低劑量組10 9.68 ±0.64 4.34 ±0.70 0.267 ±0.032

3.4 對小鼠游泳后血清尿素氮的影響 與正常對照組比較，角鯊烯膠丸 3.6、1.8、0.9 mL/kg 劑量組均能顯著降低小鼠長時間游泳后的血尿素氮水平(P＜0.001，P＜0.05)。結(jié)果見表4。

表4 角鯊烯膠丸對小鼠游泳后血尿素氮的影響作用(± s，n=10)

表4 角鯊烯膠丸對小鼠游泳后血尿素氮的影響作用(± s，n=10)

注:與對照組比較，*P ＜0.05，＊＊＊P ＜0.001。

組別 動物數(shù)/只 血尿素氮/(mmol·L-1)對照組10 13.68 ±0.74角鯊烯高劑量組 10 10.97 ±1.26＊＊＊角鯊烯中計量組 10 11.99 ±1.70*角鯊烯低劑量組 10 11.94 ±1.69*

3.5 對小鼠游泳后肝糖原的影響 與正常對照組比較，角鯊烯膠丸3.6、1.8 mL/kg劑量組顯著增加小鼠長時間游泳后的肝糖原水平(P ＜0.001，P ＜0.05)。結(jié)果見表5。

表5 角鯊烯膠丸對小鼠游泳后肝糖原的影響作用(± s，n=10)

表5 角鯊烯膠丸對小鼠游泳后肝糖原的影響作用(± s，n=10)

注:與對照組比較，*P ＜0.05，＊＊＊P ＜0.001。

組別 動物數(shù)/只 肝糖原/(mg·g-1)對照組10 5.36 ±0.78角鯊烯高劑量組 10 11.13 ±1.83＊＊＊角鯊烯中計量組 10 7.32 ±1.96*角鯊烯低劑量組10 6.72 ±1.17

4 討論

體力性疲勞的出現(xiàn)與機體運動過程中的能量消耗、代謝物堆積和機體內(nèi)環(huán)境變化等因素有關(guān)。因此延緩疲勞的產(chǎn)生和加快疲勞的清除是對抗體力性疲勞的重要方法。實驗結(jié)果表明，角鯊烯能減少小鼠游泳后血乳酸的生成，使運動后機體的血乳酸量處于較低水平;減少長時間運動過程中蛋白質(zhì)的分解代謝，使血尿素氮生成減少;同時其還能增加肝糖原儲備，改善機體內(nèi)環(huán)境狀態(tài)，達到抗疲勞的目的。

生化指標(biāo)在機體出現(xiàn)疲勞之前就已經(jīng)發(fā)生改變，因此可以用反映疲勞的生化指標(biāo)如血乳酸、血尿素氮和肝糖原來反映疲勞程度［7］。在長時間劇烈運動后，機體相對缺氧，糖酵解加快，產(chǎn)生大量乳酸，使肌肉中H+濃度上升，pH值下降，導(dǎo)致疲勞。肌肉中大量乳酸向血液中擴散，在乳酸脫氫酶(LDH)的作用下血乳酸生成丙酮酸后被代謝。提高LDH的活力是加速乳酸清除方法之一，從而達到抗疲勞的目的［8］。實驗結(jié)果表明，角鯊烯并非通過作用于LDH而加快血乳酸的平均清除率?？赡艿臋C制是通過提高血氧飽和度，增強有氧代謝而實現(xiàn)減少血乳酸量。

血尿素氮(BUN)是評價機體在運動負荷時承受能力的指標(biāo)之一。BUN量隨運動負荷的增加而增加，機體對負荷適應(yīng)能力越差，BUN的增加就越明顯［9］。當(dāng)機體較長時間運動后，不能通過糖、脂肪分解代謝獲得足夠的能量時，蛋白質(zhì)與氨基酸分解代謝加強，血尿素氮含量增加。本實驗結(jié)果表明，小鼠長時間游泳致血尿素氮的增加得到了明顯抑制，說明機體的蛋白質(zhì)分解代謝降低，運動所需的能量物質(zhì)來自糖原的分解。給予角鯊烯后，小鼠體內(nèi)糖原儲備增加，為長時間運動提供直接的能量供應(yīng)，從而減少了蛋白質(zhì)和氨基酸的分解代謝。肝糖原儲備的增加與角鯊烯護肝作用有一定的關(guān)系。

另一方面，運動耐力的提高也是抗疲勞能力的表現(xiàn)之一。游泳時間和轉(zhuǎn)棒時間長短可以反映動物運動疲勞的程度，時間延長表明運動能力和抗疲勞能力增強。冷水游泳加入了惡劣環(huán)境的外部影響，綜合應(yīng)激和運動疲勞。冷應(yīng)激可引起脂質(zhì)過氧化反應(yīng)增強，發(fā)生一系列酶促氧化還原反應(yīng)，產(chǎn)生大量自由基［10］。而自由基和脂質(zhì)過氧化損傷與運動性疲勞的發(fā)生密切相關(guān)［11］。一分子角鯊烯中具有6個烯鍵，因此具有極強的抗氧化作用，可以對機體過氧化反應(yīng)起到保護作用。

綜上所述，角鯊烯具有顯著的抗疲勞作用。作用機制與其具有改善機體新陳代謝、增加糖原儲備、增強有氧代謝和抗氧化應(yīng)激反應(yīng)有關(guān)。

［1］余 謙，李明富，宋開潭，等.中醫(yī)藥抗體力性疲勞的整體思辨與應(yīng)用前景［J］.中國運動醫(yī)學(xué)雜志，2001，20(1):3-4.

［2］趙振東，孫震.生物活性角鯊烯的資源及其應(yīng)用研究進展［J］.林產(chǎn)化學(xué)與工業(yè)，2004，24(3):107-112.

［3］王建華，陳紅艷，耿 淼，等.六味地黃口服液對冷應(yīng)激小鼠的保護作用［J］.解放軍藥學(xué)學(xué)報，2008，24(5):398-400.

［4］安述明，曾慶文，徐 浩，等.αCaMKII在前腦過量表達損傷小鼠靈活性學(xué)習(xí)能力［J］.華東師范大學(xué)學(xué)報:自然科學(xué)版，2010(2):111-118.

［5］劉 娜，李湘濃，吳 翱，等.大豆寡肽抗疲勞作用的實驗研究［J］.中國實驗診斷學(xué)，2010，4(2):201-203.

［6］翟鵬貴，趙珺彥，祝玲棟，等.西洋參制劑抗疲勞作用的實驗研究［J］.浙江中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2007，31(6):761-762.

［7］曲中原.刺五加總苷抗疲勞實驗研究［J］.中成藥，2009，31(3):474-476.

［8］Stainsby W N.Biochemical and physiological bases for lactate production［J］.Med Sci Sports Exerc，1986，18(3):341.

［9］金宗濂，文 鏡，唐粉芳，等.功能食品評價原理及方法［M］.北京:北京大學(xué)出版社，1995:47-62.

［10］吳步猛，陳錫文，金月玲，等.冷應(yīng)激對銅預(yù)投大鼠血清銅鋅代謝、SOD活性及GSH含量的影響［J］.廣東微量元素科學(xué)，2005，12(4):18.

［11］Davies K J，Quintanilha A T，Brooks G A，et al.Free radicals and tissue demage produced by exereise［J］.Biochem Biophys Res Commun，1982，107(4):1198.