痛經(jīng)滴丸的主要藥效學(xué)研究

范自全， 周明眉*， 邱明豐， 郭 孜， 陳 麗

(1.上海中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)方證與系統(tǒng)生物學(xué)研究中心，上海市教委中醫(yī)內(nèi)科E研究院，上海201203;2.上海交通大學(xué)藥學(xué)院，上海200240)

痛經(jīng)是青春期婦女的常見病之一，其中以無器質(zhì)性病變，與激素釋放和植物神經(jīng)紊亂有關(guān)的原發(fā)性痛經(jīng)為多見。中醫(yī)認為痛經(jīng)主要是由于血瘀停滯、瘀阻胞宮、胞脈，使經(jīng)行滯澀，不通則痛。治療上以理氣活血、行瘀止痛為治則。痛經(jīng)滴丸由常用婦科中藥當歸、溫中中藥肉桂、止痛中藥延胡索組成，處方功效、主治為溫通經(jīng)脈、活血祛瘀、行氣止痛，用于由寒凝血瘀、氣滯血瘀所致的婦女痛經(jīng)。本實驗參照《中藥新藥研究指南》，進行了以痛經(jīng)為主要適應(yīng)癥的藥效學(xué)研究，考察痛經(jīng)滴丸對熱板、醋酸扭體等小鼠疼痛模型、小鼠耳腫脹等炎癥模型、小鼠痛經(jīng)模型以及未孕大鼠的在體子宮的影響，以期為臨床應(yīng)用提供參考。

1 實驗材料與方法

1.1 實驗動物 昆明種小鼠，體質(zhì)量18～22 g，雌性SD大鼠，體質(zhì)量220～250 g，由中國科學(xué)院上海斯萊克實驗動物有限公司提供，動物合格證號:SCXK(滬)2007-0005，飼養(yǎng)于上海中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心，設(shè)施使用許可證:SYXK(滬)2009-0069，室內(nèi)溫度20～25℃，相對濕度40% ～70%，12 h循環(huán)照明。

1.2 藥品及試劑 痛經(jīng)滴丸由上海交通大學(xué)藥學(xué)院邱明豐副教授提供，每 1.47 g滴丸粉相當于生藥 36 g，批號20100824;痛經(jīng)寶顆粒，河南省宛西制藥份有限公司出品，批號100512。

苯甲酸雌二醇(上海通用藥業(yè)股份有限公司，批號090502);縮宮素注射液(上海第一生化藥業(yè)有限公司委托上海信誼金朱藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，批號091062);氯化鈉注射液(0.9%氯化鈉，安徽雙鶴藥業(yè)有限責任公司，批號100119);冰醋酸(國藥集團化學(xué)試劑有限公司，批號T20080108);二甲苯(國藥集團化學(xué)試劑有限公司，批號F20060419);戊巴比妥鈉(上海化學(xué)試劑廠分裝產(chǎn)品，批號WS20090520)。實驗所用試劑均為分析純。

1.3 實驗儀器 BS124S型電子分析天平(北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司);YLS-6B型智能熱板儀(山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院設(shè)備站);RM6240B型生理實驗系統(tǒng)(成都儀器廠);JZJ01H型肌肉張力換能器(成都儀器廠)。

2 給藥劑量與數(shù)據(jù)處理方法

2.1 給藥劑量與方法 痛經(jīng)滴丸的高、中、低劑量分別為12、6、3 g/kg(分別相當于60 kg成人每1 kg日用量的20倍、10倍和5倍)，選用痛經(jīng)寶顆粒作為陽性對照藥，給藥劑量為7.5 g/kg(相當于60 kg成人每1 kg日用量的20倍)，試驗藥品均以蒸餾水溶解后給藥，痛經(jīng)模型組給予相同容量的蒸餾水。

3 方法與結(jié)果

3.1 痛經(jīng)滴丸對熱刺激致小鼠疼痛的影響［3］取昆明種雌性小鼠，使用智能熱板儀重復(fù)測定小鼠正常痛閾值兩次，選取基礎(chǔ)痛閾在5～30 s之間的50只小鼠，按痛閾值隨機分為正常對照組，痛經(jīng)滴丸高、中、低劑量組和痛經(jīng)寶顆粒組，每組10只。按2.1項方法灌胃給藥，每天1次，連續(xù)5 d。于末次給藥后60 min測小鼠痛閾值，比較組間差異，結(jié)果見表1。

表1 痛經(jīng)滴丸對熱刺激致小鼠疼痛的影響 (±s，n=10)

表1 痛經(jīng)滴丸對熱刺激致小鼠疼痛的影響 (±s，n=10)

注:與正常對照組比較，*P ＜0.05，＊＊ P ＜0.01。

/s正常對照 － 17.48 ±5.07 15.17 ±4.29痛經(jīng)滴丸 12 17.31 ±3.40 20.18 ±4.01*痛經(jīng)滴丸 6 16.91 ±5.50 19.95 ±4.77*痛經(jīng)滴丸 3 17.40 ±2.90 19.55 ±3.94*痛經(jīng)寶顆粒 7.5 17.98 ±5.39 22.25 ±5.98＊＊組別 給藥劑量/(g·kg－1)給藥前痛閾/s給藥后痛閾

表1結(jié)果顯示，滴丸高、中、低劑量組均有明顯提高小鼠熱板法痛閾值的作用，與正常組相比，具有顯著性差異(P＜0.05)，陽性藥痛經(jīng)寶顆粒的鎮(zhèn)痛作用具有極顯著性差異(P ＜0.01)。

3.2 痛經(jīng)滴丸對醋酸致小鼠扭體次數(shù)的影響［3-4］取小鼠50只，雌雄各半，體質(zhì)量18～22 g，稱質(zhì)量標記后將動物隨機分為正常對照組、痛經(jīng)滴丸高、中、低劑量組和痛經(jīng)寶顆粒組，每組10只。按2.1項所述方法灌胃給藥，連續(xù)5 d。末次給藥后1 h，腹腔注射0.7%醋酸溶液0.2 mL/只，觀察并記錄注射醋酸溶液后各組小鼠30 min內(nèi)出現(xiàn)扭體反應(yīng)(腹部收縮內(nèi)凹、伸展后肢、臀部抬高、蠕行)的次數(shù)，比較各組差異，評價藥物的鎮(zhèn)痛作用。結(jié)果見表2。

表2 痛經(jīng)滴丸對醋酸致小鼠扭體次數(shù)的影響(± s，n=10)

表2 痛經(jīng)滴丸對醋酸致小鼠扭體次數(shù)的影響(± s，n=10)

注:與正常對照組比較，*P ＜0.05，＊＊ P ＜0.01。

組別 給藥劑量/(g·kg－1) 扭體次數(shù)/(次·30 min－1)正常對照28.1 ±11.8痛經(jīng)滴丸 12 15.8 ±7.7＊＊痛經(jīng)滴丸 6 17.7 ±7.9*痛經(jīng)滴丸 3 20.6 ±13.2痛經(jīng)寶顆粒 7.5 15.6 ±5.2－＊＊

表2結(jié)果表明，痛經(jīng)滴丸具有較強的鎮(zhèn)痛活性，而且呈現(xiàn)出劑量依賴性關(guān)系，當劑量為12 g/kg時，對醋酸致小鼠扭體的鎮(zhèn)痛效果具有極顯著性統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)，中劑量6 g/kg具有明顯鎮(zhèn)痛作用(P＜0.05);陽性對照藥痛經(jīng)寶顆粒7.5 mg/kg也顯示出較強的鎮(zhèn)痛活性(P＜0.01)。

3.3 痛經(jīng)滴丸對二甲苯所致小鼠耳腫脹的影響［1，3］取昆明種小鼠50只，雌雄各半，按體質(zhì)量隨機分為5組，每組10只。分別灌胃給予痛經(jīng)滴丸及痛經(jīng)寶顆粒。末次給藥后1 h，于小鼠右耳兩面涂二甲苯30 μL/只致炎。2 h后處死動物，取左右耳相同部位的圓片，以左右耳片質(zhì)量之差作為腫脹度，比較各組間差異。見圖1。

圖1 痛經(jīng)滴丸對二甲苯所致小鼠耳腫脹的影響

對二甲苯致小鼠耳腫脹的抑制作用以耳腫脹度進行評價，結(jié)果如圖1所示，發(fā)現(xiàn)痛經(jīng)滴丸12 g/kg能夠極顯著地抑制

二甲苯所致小鼠耳急性炎性腫脹(P＜0.01)，6、3 g/kg均能明顯抑制二甲苯所致小鼠耳急性炎性腫脹(P＜0.05);痛經(jīng)寶顆粒7.5 g/kg能極明顯地抑制二甲苯所致小鼠耳急性炎性腫脹(P ＜0.01)。

3.4 痛經(jīng)滴丸對縮宮素致痛經(jīng)小鼠模型的影響［2］取昆明種雌性小鼠60只，稱質(zhì)量標記后隨機分為正常對照組，痛經(jīng)模型組，痛經(jīng)滴丸高、中、低劑量組和陽性藥組，每組10只。以苯甲酸雌二醇和縮宮素制造原發(fā)性痛經(jīng)模型。按10 mg/kg腹腔注射苯甲酸雌二醇注射液，連續(xù)5 d，以增加子宮平滑肌對藥物的敏感性。同時按2.1項灌胃給藥，于末次給藥后1 h，腹腔注射催產(chǎn)素30 U/kg，以扭體反應(yīng)為子宮強烈收縮的指標，記錄注射后30 min內(nèi)小鼠的扭體發(fā)生率及次數(shù)，結(jié)果見表3。

表3 痛經(jīng)滴丸對縮宮素所致小鼠疼痛扭體的影響 (± s，n=10)

表3 痛經(jīng)滴丸對縮宮素所致小鼠疼痛扭體的影響 (± s，n=10)

注:與模型組比較，*P ＜0.05。

組別 劑量/(g·kg－1)扭體發(fā)生率/%扭體次數(shù)/(次·30 min－1)正常對照組 －00模型組 － 100 24.3±11.8痛經(jīng)滴丸 12 80 11.9 ±8.1*痛經(jīng)滴丸 6 90 13.6 ±12.7*痛經(jīng)滴丸 3 90 15.5 ±9.5痛經(jīng)寶顆粒 7.5 100 13.8 ±11.5*

表3結(jié)果顯示，與正常組比較，模型組小鼠30 min內(nèi)扭體反應(yīng)次數(shù)和扭體反應(yīng)發(fā)生率明顯增多，正常組扭體發(fā)生率和次數(shù)均為0，可能是縮宮素對未經(jīng)雌化的子宮效果不明顯。與模型組相比，痛經(jīng)滴丸高、中劑量組使小鼠扭體反應(yīng)次數(shù)均明顯降低(P＜0.05);痛經(jīng)滴丸高、中、低劑量組動物扭體反應(yīng)發(fā)生率也有所降低。

3.5 痛經(jīng)滴丸對大鼠在體子宮平滑肌的影響［5-7］取成年未孕正常雌性SD大鼠48只，隨機分為正常對照組、模型組、痛經(jīng)滴丸高、中、低劑量組和陽性藥組，每組8只。實驗前腹腔注射苯甲酸雌二醇8 mg/kg，連續(xù)3 d，以促其處于動情前期或動情期，提供子宮對藥物的敏感性。實驗前禁食12 h，次日各組按2.1項方法給藥，模型組給予等體積蒸餾水。給藥后1 h，戊巴比妥鈉麻醉，取仰位固定于手術(shù)臺，下腹部剪毛，做一切口分離顯露子宮，分離右側(cè)子宮卵巢端及陰道端，中間用縫合線連接肌張力換能器，待曲線收縮平衡后，記錄其10 min內(nèi)的平均張力(g)和收縮頻率(次/10 min);然后經(jīng)靜脈注射縮宮素1.0 U/kg，待穩(wěn)定后，記錄其10 min內(nèi)的平均張力(g)和收縮頻率(次/10 min)，結(jié)果見表4。

表4結(jié)果顯示，單次給予痛經(jīng)滴丸后，痛經(jīng)滴丸各劑量組對正常大鼠在體子宮收縮張力和頻率無明顯影響(P＞0.05);模型組大鼠子宮平滑肌在加入縮宮素后10 min內(nèi)的平均張力升高，為給縮宮素前將近4倍，與正常組相比，具有顯著性差異(P＜0.01)，痛經(jīng)滴丸高劑量和痛經(jīng)寶顆粒均能極顯著降低加縮宮素后大鼠在體子宮收縮張力(P＜0.01)，痛經(jīng)滴丸中劑量和低劑量能夠明顯降低加縮宮素后大鼠在體子宮收縮張力(P＜0.05);各給藥組對加縮宮素后大鼠在體子宮收縮頻率無明顯改變(P＞0.05)。

表4 痛經(jīng)滴丸對大鼠在體子宮平滑肌的影響 (± s，n=8)

表4 痛經(jīng)滴丸對大鼠在體子宮平滑肌的影響 (± s，n=8)

注:與縮宮素組比較，*P＜0.05，＊＊ P ＜0.01。

組別 劑量/(g·kg－1)加縮宮素前 加縮宮素后平均張力/g 頻率/(次·10 min－1) 平均張力/g 頻率/(次·10 min－1)正常對照0.65 ±0.23 9.12 ±3.40 － －模型組 － 0.74±0.18 9.12±1.13 2.58±0.70 9.00±1.69痛經(jīng)滴丸 9.6 0.68±0.35 9.12±0.68 1.68±0.82＊＊ 9.25±2.38痛經(jīng)滴丸 4.8 0.75 ±0.16 10.38 ±0.75 1.86 ±0.44* 10.75 ±2.05痛經(jīng)滴丸 2.4 0.74 ±0.18 9.62 ±0.74 1.88 ±0.66* 9.50 ±1.41痛經(jīng)寶顆粒 6 0.63 ±0.05 10.12 ±2.47 1.69 ±0.44＊＊－10.88 ±1.73

4 討論

痛經(jīng)多與子宮平滑肌痙攣性收縮、子宮供血不足或子宮炎癥有關(guān)。痛經(jīng)滴丸由常用中藥當歸、肉桂和延胡索三味藥組成，是由痛經(jīng)寶顆粒處方簡化而來，具有處方更簡化、劑型更優(yōu)化的特點。目前此三味藥的配伍處方僅見相關(guān)臨床應(yīng)用報道［8-10］，尚無確切治療痛經(jīng)的藥理學(xué)實驗數(shù)據(jù)可查;市場上現(xiàn)有治療痛經(jīng)藥物有限，其中“月月舒”痛經(jīng)寶顆粒為河南宛西制藥廠出品，被認定為“中國中藥名牌”產(chǎn)品，產(chǎn)品國內(nèi)市場的覆蓋率為98%，綜合市場占有率達到11.98%［11］，這也決定了進行痛經(jīng)滴丸研發(fā)具有實際應(yīng)用價值。

熱板法和醋酸扭體法分別為物理性和化學(xué)性鎮(zhèn)痛模型，后者是一個研究內(nèi)臟疼痛的模型，廣泛用于中樞和外周疼痛的研究，有報道［12］顯示前列腺素的生物合成在疼痛模型的疼痛機制中具有重要作用。痛經(jīng)滴丸對疼痛模型的作用提示其對于前列腺素的合成有影響，相關(guān)研究有待進一步開展。Ribeiro等［13］發(fā)現(xiàn)醋酸扭體法與腹腔巨噬細胞和柱狀細胞相關(guān)，有必要進行藥物對腹腔巨噬細胞和柱狀細胞功能和炎癥介質(zhì)改變的研究。

制備痛經(jīng)模型的致敏藥物多選擇己烯雌酚，也有選擇苯甲酸雌二醇;根據(jù)各文獻所使用的雌激素種類、劑量、作用時間、途徑等的不同，雌激素的用量也不一致，文獻多采用1～20 mg/kg腹腔或皮下注射給藥［14］。我們根據(jù)制備痛經(jīng)模型的周期，參考文獻［12］中的方法，選擇給予苯甲酸雌二醇，小鼠連續(xù)5 d腹腔注射10 mg/kg，大鼠連續(xù)3 d腹腔注射8 mg/kg的方法制備痛經(jīng)模型，制備的模型效果較理想。

實驗中對在體子宮收縮的評價有多種指標可以進行選擇，可以用收縮頻率、收縮幅度和平均收縮張力等多種指標進行描述，也有文獻選取子宮活動力、延長子宮收縮時間［11］或基線提高［6］等。對于不同的藥物以及同種藥物不同劑量，這些指標的變化趨勢可能有所不同。平均收縮張力是在單位時間子宮收縮曲線下面積，體現(xiàn)了一段時間內(nèi)的平均值，能較全面反映子宮的收縮變化，故本實驗采用平均收縮張力為指標進行統(tǒng)計。子宮是一個復(fù)雜的器官，存在多種調(diào)控子宮活性的途徑，如前列腺素受體、縮宮素受體、血管加壓素受體、H1受體、5-HT受體、M 受體、α、β受體及 Ca2+通道等［12］。實驗中發(fā)現(xiàn)，痛經(jīng)滴丸對給予縮宮素前的子宮收縮作用并不明顯，這可能是由于痛經(jīng)滴丸是與縮宮素受體相作用，在給予縮宮素后，由于受體與縮宮素結(jié)合的途徑被阻斷或拮抗，因此子宮收縮力受到抑制，而收縮的頻率卻不受到抑制。

本研究以痛經(jīng)寶顆粒為對照藥物，通過鎮(zhèn)痛、抗炎試驗、小鼠痛經(jīng)模型等整體實驗以及大鼠在體子宮試驗評價痛經(jīng)滴丸的主要藥效，結(jié)果顯示痛經(jīng)滴丸能夠減少醋酸所致痛經(jīng)模型小鼠的扭體次數(shù)，對抗二甲苯所致耳腫脹炎癥的作用，并有明顯抑制縮宮素致小鼠痛經(jīng)模型和大鼠在體子宮收縮的作用，這與中藥當歸、肉桂和延胡索的單味藥效相一致，與對照藥物痛經(jīng)寶顆粒作用強度相當，為本藥的開發(fā)應(yīng)用于預(yù)防和治療原發(fā)性痛經(jīng)提供了初步藥理學(xué)依據(jù)。

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