李 磊，徐列兵，陳世云，趙英杰

(1.中國石油集團(tuán)石油職業(yè)衛(wèi)生技術(shù)服務(wù)中心，河北 廊坊 065000；2.中國石油管道公司濟(jì)南輸油分公司，山東 濟(jì)南 250014；3.廊坊師范學(xué)院管理學(xué)院，河北 廊坊 065000)

多種小分子(離子)物質(zhì)同時(shí)與生物大分子結(jié)合及彼此間的影響已經(jīng)引起研究者的關(guān)注[1～5]。Chen等[6]利用生物作用色譜(Biointeraction chromatography)技術(shù)以血清白蛋白為固定相考察了一種藥物(變構(gòu)劑)對(duì)另一種藥物與蛋白質(zhì)結(jié)合所產(chǎn)生的變構(gòu)效應(yīng)(Allosteric effect)[6～8]，報(bào)道了蛋白質(zhì)-藥物結(jié)合的定量變構(gòu)系數(shù)，為探討多種藥物分子在結(jié)合蛋白質(zhì)過程中的競(jìng)爭(zhēng)作用提供了新的思路。目前，大部分報(bào)道僅局限于金屬離子對(duì)蛋白質(zhì)-藥物分子結(jié)合過程的影響研究[1～5]，而關(guān)于金屬離子對(duì)蛋白質(zhì)-藥物分子結(jié)合過程的變構(gòu)效應(yīng)少有報(bào)道。

考慮到在色譜技術(shù)中蛋白質(zhì)作為固定相其原有性質(zhì)可能改變以及蛋白質(zhì)隨流動(dòng)相的洗脫損失，采用光譜技術(shù)研究藥物分子對(duì)牛血清白蛋白(Bovine serum albumin，BSA)-金屬離子結(jié)合過程的變構(gòu)效應(yīng)已有報(bào)道[9]。作者選取金屬離子Cu2+、Zn2+作為變構(gòu)劑，分別采用熒光光譜(FS)、紫外可見吸收光譜(UV-Vis)以及圓二色譜(CD)考察了Cu2+/Zn2+對(duì)中藥有效成分鹽酸小檗堿(Berberine chloride，BC)與BSA結(jié)合過程的變構(gòu)效應(yīng)，并從BSA分子構(gòu)象轉(zhuǎn)變角度對(duì)變構(gòu)效應(yīng)產(chǎn)生的可能機(jī)制進(jìn)行了探討，以期為金屬離子對(duì)血漿中外源藥物的儲(chǔ)存和分布的影響以及后續(xù)生物效應(yīng)的研究提供有用信息。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 試劑與儀器

牛血清白蛋白(>98%，BSA Fraction Ⅴ)，上海華美生物工程公司；鹽酸小檗堿，自制[10]；Tris(生化試劑)、ZnCl2(分析純)、CuCl2·2H2O(分析純)，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；其它試劑均為分析純。

RF-5301PC型熒光光度計(jì)，日本島津公司；TU-1901型紫外可見分光光度計(jì)，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；J-715型圓二色光譜儀，日本JASCO公司。

1.2 方法

分別以Cu2+/Zn2+濃度(×10-5mol·L-1)為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0的Tris-HCl緩沖溶液(37 ℃下pH=7.4，內(nèi)含0.15 mol·L-1NaCl以維持溶液離子強(qiáng)度)為溶劑配制1.0×10-5mol·L-1的BSA標(biāo)準(zhǔn)溶液，備用。在三角瓶中精確移入一定量1.5×10-2mol·L-1的BC甲醇標(biāo)準(zhǔn)溶液，迅速吹干溶劑，準(zhǔn)確移入BSA標(biāo)準(zhǔn)溶液10 mL，超聲分散3 min，在(37±0.1) ℃下恒溫3 h至結(jié)合平衡。激發(fā)波長(zhǎng)為295 nm，激發(fā)光柵和發(fā)射光柵狹縫寬度均為3 nm，恒溫測(cè)定上述樣品在300～500 nm的熒光發(fā)射光譜。

分別以Cu2+/Zn2+濃度(×10-5mol·L-1)為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0的Tris-HCl緩沖溶液為溶劑配制1.0×10-5mol·L-1的BC溶液，測(cè)定其在300～500 nm的紫外可見吸收光譜，以相應(yīng)的Tris-HCl緩沖溶液為參比。

以2.0×10-6mol·L-1的BSA的Tris-HCl溶液為溶劑配制BC與Cu2+/Zn2+成一定濃度比的Cu2+/Zn2+-BSA-BC溶液，測(cè)定其在190～250 nm 的圓二色譜(色譜條件參照文獻(xiàn)[11,12])。

2 結(jié)果與討論

2.1 Cu2+/Zn2+對(duì)BC猝滅BSA內(nèi)源性熒光的變構(gòu)效應(yīng)

BSA分子中含有熒光性氨基酸殘基(色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸)，為內(nèi)源性熒光物質(zhì)。在Cu2+存在下，BC對(duì)BSA內(nèi)源性熒光的猝滅作用見圖1。

由圖1可知，當(dāng)激發(fā)波長(zhǎng)為295 nm時(shí)，BSA的熒光發(fā)射峰在343 nm附近，與BSA-BC二元體系類似[10]。當(dāng)BC濃度低于1.0×10-5mol·L-1時(shí)，BSA在343 nm處的熒光發(fā)射峰強(qiáng)度隨BC濃度的增大而降低，但峰形和出峰位置基本不變；當(dāng)BC濃度超過1.0×10-5mol·L-1時(shí)，BSA的熒光發(fā)射峰強(qiáng)度不僅隨BC濃度的增大而降低，并且出現(xiàn)峰裂分[10]。

cCu2+=cBSA=1.0×10-5 mol·L-1 1～9，cBC(×10-5 mol·L-1)：0,0.525,1.0,1.5,2.025,2.55,3.0,3.525,4.05

考慮到峰裂分，以熒光發(fā)射峰峰面積S代替熒光發(fā)射峰強(qiáng)度，按照Stern-Volmer方程和Perrin方程[即式S0/S=1+KSVcBC和式ln(S0/S)=KPcBC，式中：S和S0分別為有、無BC時(shí)BSA的熒光發(fā)射峰面積；KSV、KP為熒光猝滅常數(shù)；cBC為BC濃度][10]對(duì)0.2×10-5mol·L-1Cu2+/Zn2+存在下BC對(duì)BSA的熒光猝滅數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，結(jié)果見圖2。

圖2 Cu2+/Zn2+存在下，BSA-BC體系的Stern-Volmer(a)和Perrin(b)曲線

線性擬合得到BSA-BC體系的Stern-Volmer方程和Perrin方程，計(jì)算猝滅常數(shù)KSV、KP，結(jié)果見表1。

由表1可見，在BSA-BC體系中分別加入Cu2+、Zn2+后，各體系線性擬合后所得KSV為104數(shù)量級(jí)，由KSV=kqτ0[13][kq為擴(kuò)散過程控制的雙分子動(dòng)態(tài)猝滅速率常數(shù)(L·mol-1·s-1)，τ0為生物大分子內(nèi)源性熒光壽命，對(duì)于BSA一般取6.3 ns[14]]求得雙分子kq大于各種猝滅體對(duì)生物大分子的最大擴(kuò)散猝滅速率常數(shù)2×1010L·mol-1·s-1 [15]，可以初步判定Cu2+/Zn2+存在下，BC對(duì)BSA的熒光猝滅并非由于分子擴(kuò)散和動(dòng)態(tài)碰撞引起的動(dòng)態(tài)猝滅，而是由于BC與BSA形成復(fù)合物而引起的靜態(tài)猝滅。

參照文獻(xiàn)[9]，定義猝滅變構(gòu)系數(shù)βQ=KP/KP,0，其中KP和KP,0分別為有、無Cu2+/Zn2+時(shí)BC對(duì)BSA熒光的猝滅常數(shù)，結(jié)果見表1。以βQ對(duì)金屬離子濃度作圖，如圖3所示。

表1 Cu2+/Zn2+存在下，BSA-BC體系的KSV、KP、βQ、r、J、E

圖3 βQ隨金屬離子濃度的變化關(guān)系

由圖3可知，與BSA-BC二元體系比較，金屬離子存在下BSA-BC體系的KP有所增大(即βQ>1)，變構(gòu)劑Cu2+/Zn2+對(duì)BC猝滅BSA內(nèi)源性熒光的過程產(chǎn)生正變構(gòu)效應(yīng)，且在低濃度(<0.2×10-5mol·L-1)情況下，變構(gòu)效應(yīng)比較明顯；隨著金屬離子濃度的增大，變構(gòu)效應(yīng)趨于平緩。與BC作為變構(gòu)劑不同[9]，Cu2+/Zn2+作為變構(gòu)劑時(shí)，其變構(gòu)效率存在飽和性，即趨于一定值，其原因可能為Cu2+對(duì)BSA內(nèi)源性熒光猝滅效率遠(yuǎn)小于BC[10,16]，BC一定程度“掩蓋”了Cu2+的變構(gòu)效應(yīng)，而Zn2+本身對(duì)BSA的內(nèi)源性熒光不產(chǎn)生猝滅效應(yīng)[16]。

根據(jù)F?rster無輻射的能量轉(zhuǎn)移理論[17]和變構(gòu)劑Cu2+/Zn2+存在下BC的紫外可見吸收光譜與BSA的熒光光譜的重疊(圖4),計(jì)算變構(gòu)劑Cu2+/Zn2+存在下BC與BSA熒光性氨基酸殘基之間的空間距離r(K2=2/3，N=1.336，Φ=0.15[10])，結(jié)果見表1。

1.UV-Vis of BC 2.FS of BSA cBC=1.0×10-5 mol·L-1 cBSA=1.0×10-5 mol·L-1

由表1可知，有、無Cu2+/Zn2+存在時(shí)，r都小于7 nm，表明BC與BSA之間存在非輻射能量轉(zhuǎn)移，這是發(fā)生熒光猝滅的原因之一[17]。與BSA-BC二元體系比較，Cu2+/Zn2+使BSA-BC分子間空間距離r減小，必然導(dǎo)致BC對(duì)BSA內(nèi)源性熒光猝滅能力增強(qiáng)，這可能是Cu2+/Zn2+對(duì)BC猝滅BSA內(nèi)源性熒光過程具有正變構(gòu)效應(yīng)的直接原因。此外，與BSA-BC二元體系比較，Cu2+/Zn2+存在下BSA熒光發(fā)射光譜與BC紫外可見吸收光譜的重疊積分J有所下降、能量轉(zhuǎn)移效率E略有上升(表1)，說明Cu2+/Zn2+對(duì)BC與BSA之間的能量轉(zhuǎn)移產(chǎn)生了影響。

2.2 Cu2+/Zn2+對(duì)BSA-BC復(fù)合物穩(wěn)定性和結(jié)合位點(diǎn)數(shù)的變構(gòu)效應(yīng)

按照式S0/S=KAcBCS0/(S0-S)-nKAcBSA[10],對(duì)0.2×10-5mol·L-1Cu2+/Zn2+存在下BSA-BC體系的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，得到圖5。

圖5 Cu2+/Zn2+存在下，BSA-BC體系cBCS0/(S0-S)～S0/S的關(guān)系曲線

擬合得到線性方程，再由方程的斜率和截距得到表觀結(jié)合常數(shù)KA和結(jié)合位點(diǎn)數(shù)n，并定義結(jié)合變構(gòu)系數(shù)βA=KA/KA,0、βn=n/n0(其中KA,0、KA和n0、n分別為加入Cu2+/Zn2+前后BSA-BC結(jié)合的表觀結(jié)合常數(shù)和結(jié)合位點(diǎn)數(shù))[9]，結(jié)果見表2。

表2 Cu2+/Zn2+存在下，BSA-BC結(jié)合過程的表觀結(jié)合常數(shù)KA、結(jié)合位點(diǎn)數(shù)n、變構(gòu)系數(shù)βA和βn

由表2可知，0<βA<1和0<βn<1表明Cu2+/Zn2+對(duì)BSA-BC復(fù)合物穩(wěn)定性和結(jié)合位點(diǎn)數(shù)都具有負(fù)變構(gòu)效應(yīng)，說明Cu2+/Zn2+存在時(shí)使BSA-BC復(fù)合物穩(wěn)定性下降，進(jìn)而使BC在血液中的存儲(chǔ)時(shí)間縮短，釋放速度加快，同時(shí)其游離濃度增大。KA較BSA-BC二元體系減小，說明加入Cu2+/Zn2+后BC、BSA與金屬離子所形成的三元復(fù)合物比BC與BSA形成的二元復(fù)合物的穩(wěn)定性低。

以變構(gòu)系數(shù)βA和βn的數(shù)值對(duì)所加入Cu2+/Zn2+的濃度作圖，結(jié)果見圖6。

圖6 βA～cCu2+(a)、βn～cCu2+(b)、βA～cZn2+(c)、βn～cZn2+(d)的關(guān)系曲線

由圖6可知，變構(gòu)效應(yīng)隨兩種變構(gòu)劑Cu2+、Zn2+濃度的增大呈現(xiàn)不同的變化趨勢(shì)：變構(gòu)劑Cu2+的結(jié)合變構(gòu)系數(shù)βA和βn與其濃度總體呈線性關(guān)系；而變構(gòu)劑Zn2+的變構(gòu)效應(yīng)呈現(xiàn)飽和性。這可能與兩者在BSA分子上的結(jié)合部位不同有關(guān)，Cu2+的結(jié)合位點(diǎn)為BSA分子中含N、O的氨基酸殘基[18]，而Zn2+的結(jié)合位點(diǎn)位于BSA分子domain Ⅰ和domain Ⅱ的交界處[19]，這可能導(dǎo)致BC的進(jìn)一步結(jié)合受到不同的影響。

通過擬合方程βA=-2.96×104cCu2++0.99(R2=0.9602)、βn=-4.96×104cCu2++0.97(R2=0.9318),計(jì)算變構(gòu)劑Cu2+的變構(gòu)效率系數(shù)[9]γA=(-2.96±0.426)×104L·mol-1、γn=(-4.96±0.950)×104L·mol-1。

可見，γA和γn均為104數(shù)量級(jí)，且|γn|>|γA|，說明Cu2+對(duì)BSA-BC復(fù)合物穩(wěn)定性的變構(gòu)效率低于其對(duì)結(jié)合位點(diǎn)數(shù)的變構(gòu)效率；總體呈線性關(guān)系說明BSA-BC復(fù)合物穩(wěn)定程度隨Cu2+濃度增大而減弱，此結(jié)果與BC作為變構(gòu)劑時(shí)相反[9]。

2.3 變構(gòu)效應(yīng)的可能機(jī)制

Cu2+/Zn2+存在下，BSA-BC的CD圖譜見圖7，由圖7計(jì)算得到的BSA-BC二級(jí)結(jié)構(gòu)含量見表3。

cBSA=2.0×10-6 mol·L-1 1～5，nCu2+∶nBSA∶nBC：0∶1∶0，0∶1∶1，1∶1∶1，0.4∶1∶1,0.8∶1∶1 6～10,nZn2+∶nBSA∶nBC:0∶1∶0，0∶1∶1，0.8∶1∶1，0.4∶1∶1,1∶1∶1

表3 Cu2+/Zn2+存在下,BSA-BC體系二級(jí)結(jié)構(gòu)的含量/%

由表3可知，變構(gòu)劑Cu2+/Zn2+使BSA-BC分子構(gòu)象中4種二級(jí)結(jié)構(gòu)(α-Helix、β-Sheet、Turn和Random)含量均有不同程度的改變，說明與BC類似，Cu2+/Zn2+的變構(gòu)效應(yīng)同樣是通過Cu2+/Zn2+與BSA結(jié)合進(jìn)而使BSA構(gòu)象改變得以實(shí)現(xiàn)的。

與BC為變構(gòu)劑時(shí)有所不同，Cu2+-BSA-BC三元體系中BSA分子的β-Sheet含量隨Cu2+濃度增大呈現(xiàn)不規(guī)律變化，而Turn結(jié)構(gòu)減少，BSA分子結(jié)構(gòu)一定程度趨于松散，這種構(gòu)象改變可能是導(dǎo)致BC與BSA分子中熒光性氨基酸殘基間的空間距離r縮小的主要原因，進(jìn)而使直接熒光猝滅和非輻射能量轉(zhuǎn)移過程變得相對(duì)容易，導(dǎo)致Cu2+對(duì)BSA-BC熒光猝滅過程呈正變構(gòu)效應(yīng)。而Zn2+-BSA-BC三元體系中，BSA分子構(gòu)象中4種二級(jí)結(jié)構(gòu)含量同樣有不同程度的改變，當(dāng)Zn2+濃度小于1×10-5mol·L-1時(shí)，Turn含量較BSA-BC二元體系略有增加，α-Helix、β-Sheet和Random含量呈現(xiàn)不規(guī)律變化；當(dāng)Zn2+濃度為1×10-5mol·L-1時(shí)，Turn含量較BSA-BC二元體系明顯減少，α-Helix、β-Sheet含量增加，這種不規(guī)律變化可能是由于Zn2+和BC在BSA分子中的結(jié)合位置比較接近(位于domain Ⅰ和domain Ⅱ的交界處)[19]，而Zn2+結(jié)合后對(duì)BSA構(gòu)象的改變同樣可能導(dǎo)致BC對(duì)BSA的直接熒光猝滅和非輻射能量轉(zhuǎn)移過程變得相對(duì)容易，呈現(xiàn)正變構(gòu)效應(yīng)。

Cu2+/Zn2+對(duì)KA和n呈負(fù)變構(gòu)效應(yīng)的原因可能也源于BSA分子構(gòu)象的轉(zhuǎn)變。因?yàn)镃u2+/Zn2+與BSA分子結(jié)合后，BSA分子構(gòu)象發(fā)生局部應(yīng)激改變，使BSA分子中容易與BC結(jié)合的疏水空腔受到一定程度的破壞，導(dǎo)致BC與BSA分子的結(jié)合變得困難(0<βA<1)、可結(jié)合的位點(diǎn)數(shù)也有所減少(0<βn<1)。

3 結(jié)論

Cu2+/Zn2+對(duì)BC猝滅BSA內(nèi)源熒光呈正變構(gòu)效應(yīng)(βQ>1)，Cu2+/Zn2+存在下，BC與BSA分子空間距離r的縮小可能是產(chǎn)生正變構(gòu)效應(yīng)的直接原因，變構(gòu)效應(yīng)隨Cu2+/Zn2+濃度的增大呈現(xiàn)一定的飽和性。Cu2+/Zn2+對(duì)BSA-BC復(fù)合物穩(wěn)定性以及BC在BSA分子上的結(jié)合位點(diǎn)數(shù)呈負(fù)變構(gòu)效應(yīng)(0<βA<1，0<βn<1)，變構(gòu)效應(yīng)隨Cu2+/Zn2+濃度的增大呈現(xiàn)不同變化趨勢(shì)：其中Zn2+對(duì)BSA-BC復(fù)合物穩(wěn)定性以及BC在BSA分子上的結(jié)合位點(diǎn)數(shù)的變構(gòu)效應(yīng)隨Zn2+濃度的增大呈現(xiàn)飽和性，而Cu2+的兩種變構(gòu)效應(yīng)總體呈線性關(guān)系，且對(duì)BSA-BC復(fù)合物穩(wěn)定性的變構(gòu)效率低于其對(duì)結(jié)合位點(diǎn)數(shù)的變構(gòu)效率。BSA分子構(gòu)象轉(zhuǎn)變可能是產(chǎn)生變構(gòu)效應(yīng)的主要原因。

參考文獻(xiàn)：

[1] Chen T T，Cao H，Zhu S J，et al.Investigation of the binding of Salvianolic acid B to human serum albumin and the effect of metal ions on the binding[J].Spectrochimica Acta Part A：Molecular and Biomolecular Spectroscopy，2011，81(1)：645-652.

[2] Peng M J，Shi S Y，Zhang Y P.The influence of Cd2+，Hg2+and Pb2+on taxifolin binding to bovine serum albumin by spectroscopic methods：With the viewpoint of toxic ions/drug interference[J].Environmental Toxicology and Pharmacology，2012，33(2)：327-333.

[3] Shaikh S M T，Seetharamappa J，Kandagal P B,et al.Invitrostudy on the binding of anti-coagulant vitamin to bovine serum albumin and the influence of toxic ions and common ions on binding[J].International Journal of Biological Macromolecules,2007，41(1):81-86.

[4] 余燕敏，馮金朝，劉穎.Fe3+存在下磺胺甲惡唑與牛血清白蛋白相互作用的光譜學(xué)研究[J].化學(xué)學(xué)報(bào)，2011，69(2)：190-198.

[5] 王騰，何曉囡，董穎，等.布南色林與人血清白蛋白相互作用的光譜學(xué)研究[J].分析試驗(yàn)室，2012，31(1)：105-109.

[6] Chen J Z，Hage D S.Quantitative analysis of allosteric drug-protein binding by biointeraction chromatography[J].Nature Biotechnology，2004，22(11)：1445-1448.

[7] Wainer I W.Finding time for allosteric interactions[J].Nature Biotechnology，2004，22(11)：1376-1377.

[8] Chen J Z，F(xiàn)itos I，Hage D S.Chromatographic analysis of allosteric effects between ibuprofen and benzodiazepines on human serum albumin[J].Chirality，2006，18(1)：24-36.

[9] 劉雪鋒，李磊，方云.牛血清白蛋白-Cu2+結(jié)合過程中鹽酸小檗堿的變構(gòu)效應(yīng)[J].化學(xué)學(xué)報(bào)，2008，66(17)：1967-1973.

[10] Liu X F，Xia Y M，F(xiàn)ang Y.Effect of metal ions on the interaction between bovine serum albumin and berberine chloride extracted from a traditional Chinese Herb coptis chinensis franch[J].Journal of Inorganic Biochemistry，2005，99(7)：1449-1457.

[11] Kandagal P B，Ashoka S，Seetharamappa J，et al.Study of the interaction of an anticancer drug with human and bovine serum albumin：Spectroscopic approach[J].Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis,2006，41(2)：393-399.

[12] Kandagal P B，Seetharamappa J，Shaikh S M T，et al.Binding of trazodone hydrochloride with human serum albumin：A spectroscopic study[J].Journal of Photochemistry and Photobiology A：Chemistry,2007，185(2-3):239-244.

[13] 王洋，陳艷萍，張業(yè)中.2,4-二氯苯酚與人血清白蛋白相互作用的研究[J].化學(xué)與生物工程，2011,28(5)：28-33.

[14] Gelamo E L，Tabak M.Spectroscopic studies on the interaction of bovine(BSA) and human serum albumins(HSA) with ionic surfactants[J].Spectrochimica Acta Part A,2000，56(11):2255-2271.

[15] Jiang C Q，Gao M X，Meng X Z.Study of the interaction between daunorubicin and human serum albumin，and the determination of daunorubicin in blood serum samples[J].Spectrochimica Acta Part A，2003，59(7)：1605-1610.

[16] 宋琤，梁宏.熒光猝滅法研究Cu(Ⅱ)和Zn(Ⅱ)離子與牛血清白蛋白結(jié)合競(jìng)爭(zhēng)[J].光譜學(xué)與光譜分析，2003，23(5)：892-894.

[17] Messina P V，Prieto G，Ruso J M，et al.Conformational changes in human serum albumin induced by sodium perfluorooctanoate in aqueous solutions[J].Journal of Physical Chemistry B，2005，109(32)：15566-15573.

[18] Bal W，Christodoulou J，Sadler P J，et al.Multi-metal binding site of serum albumin[J].Journal of Inorganic Biochemistry,1998，70(1):33-39.

[19] Stewart A J，Blindauer C A，Berezenko S，et al.Interdomain zinc site on human albumin[J].Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，2003，100(7)：3701-3706.