內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激蛋白BiP在姜黃素抗2型糖尿病神經(jīng)病理性疼痛大鼠的作用*

吳 艷，俞陳陳，曹 紅，黨江坤，連慶泉，李 軍

(溫州醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院麻醉科，溫州醫(yī)學(xué)院疼痛研究所，浙江 溫州 325027)

隨著人民生活水平的提高和人均壽命的延長，糖尿病的患病率逐年上升，其中2型糖尿病占90%，且常伴有全身肥胖或體脂分布異常。糖尿病神經(jīng)病理性疼痛(diabetic neuropathic pain，DNP)是糖尿病最常見的慢性并發(fā)癥之一，主要表現(xiàn)為自發(fā)性痛、觸誘發(fā)痛及痛覺超敏［1］。免疫球蛋白重鏈結(jié)合蛋白(immunoglobulin heavy chain－binding protein，BiP)也叫葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(glucose－regulated protein 78，GRP78)，是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress，ERS)的標(biāo)志蛋白，作為一種分子伴侶在蛋白質(zhì)的折疊和轉(zhuǎn)運過程及ERS反應(yīng)中發(fā)揮重要作用［2］。整體動物、細(xì)胞、分子水平上的實驗研究表明，ERS是聯(lián)系肥胖、胰島素抵抗和2型糖尿病的重要紐帶［3］，Martenson 等［4］研究發(fā)現(xiàn)動物存在“應(yīng)激致痛”現(xiàn)象，但是BiP在2型DNP中的作用至今缺乏研究。姜黃素是一種安全有效的具有抗腫瘤、抗氧化、抗炎等廣泛藥理作用的藥物，也具有神經(jīng)保護(hù)作用［5］。因此本研究觀察姜黃素對2型糖尿病大鼠MWT、TWL和脊髓背角及背根神經(jīng)節(jié)(dosal root ganglion，DRG)中ERS相關(guān)蛋白BiP表達(dá)的影響，旨在探討B(tài)iP在2型DNP發(fā)生發(fā)展中的作用。

材料和方法

1 動物及主要試劑

清潔級SD大鼠，雄性，體重160～180 g，由溫州醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供，許可證號:SCXK(浙)2005－0019。BiP抗體(ab53068)購自 Abcam，鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ，S0130)、姜黃素(28260)和玉米油(C8267)購自Sigma。336爪/尾刺激痛覺測試計以及2390Electrovonfrey測痛計購自ⅡTC。兔二步法試劑盒(pv－9001)及 DAB顯色劑(ZLIP018)均購自北京中杉金橋公司。Bio－Rad電泳轉(zhuǎn)膜儀購于Bio－Rad。STZ用pH 4.3的檸檬酸液配成1%貯存液，姜黃素用玉米油配成25 g/L貯存液，于4℃冰箱避光保存。

2 動物模型制備

實驗大鼠飼養(yǎng)于20～25℃、晝夜交替環(huán)境中，自由攝食攝水，實驗前適應(yīng)環(huán)境72 h。參照文獻(xiàn)［6］方法，喂以高脂高糖飼料并自由攝食、飲水。于實驗開始即第0周、飼養(yǎng)第8周分別測體重、血糖，并取血測血清胰島素，并評估胰島素敏感性。飼養(yǎng)8周后大鼠禁食不禁飲12 h后按35 mg/kg單次腹腔注射1%STZ溶液。3 d后測定大鼠尾靜脈血糖，血糖穩(wěn)定且≥16.7 mmol/L入選實驗，14 d后測大鼠痛閾，降低到基礎(chǔ)值的85%以下表示大鼠糖尿病神經(jīng)病理性疼痛模型制備成功，均入選為D組，此大組后續(xù)將進(jìn)一步分為3組觀察姜黃素對糖尿病神經(jīng)病理性疼痛的影響。其余未達(dá)到此標(biāo)準(zhǔn)者則予以剔除。

3 動物分組

采用隨機(jī)數(shù)字表法，將D組大鼠隨機(jī)分為3組(n=27):2型糖尿病神經(jīng)病理性痛組(DNP組)、2型糖尿病神經(jīng)病理性痛+姜黃素100 mg·kg－1·d－1組(DCur組)和2型糖尿病神經(jīng)病理性痛+玉米油溶劑4 mg·kg－1·d－1對照組(DSC 組)。DNP 組不作任何處理;DCur組在注射STZ 14 d后開始腹腔注射姜黃素 100 mg·kg－1·d－1，持續(xù) 14 d;DSC 組在注射STZ 14 d后開始腹腔注射姜黃素的溶劑玉米油4 mL·kg－1·d－1，持續(xù) 14 d。另取 27 只為正常對照組(C組，n=27)，給予普通飼料喂養(yǎng)，不作任何處理。

4 胰島素水平測定

胰島素敏感性指數(shù)(insulin sensitivity index，ISI)=1/(空腹血糖×空腹胰島素)=1/(fasting plasma glucose×fasting insulin，F(xiàn)PG×FINS)，此值為非正態(tài)分布，故計算時取其自然對數(shù)［7］。

5 痛閾測定

分別于注射STZ前(基礎(chǔ)狀態(tài))、注射STZ 14 d后及給姜黃素3 d、7 d、14 d后測定機(jī)械縮足痛閾(mechanical withdrawal threshold，MWT)和熱縮足潛伏期(thermal withdrawal latency，TWL)。所有測定均在固定時間(8:00～17:00)及安靜的環(huán)境下進(jìn)行，室溫維持在(24.0±0.5)℃。

5.1 MWT測定 將大鼠置于底為金屬篩網(wǎng)(1 cm×1 cm)的透明有機(jī)玻璃箱(22 cm×22 cm×22 cm)中，玻璃箱被架高于實驗臺面50 cm。待大鼠在箱中適應(yīng)15 min后，用IITC－2390型Electronic Von Fery觸覺測痛儀垂直刺激大鼠雙后趾，單次刺激時間≤1 s，刺激間隔10 s。記錄測試時大鼠出現(xiàn)抬足或舔足行為時的刺激強(qiáng)度值，測5次取平均值即為其MWT。

5.2 TWL測定 用IITC336甩尾足底測試儀于上述各時點測定TWL。將大鼠置于3 mm厚的玻璃板上，使用熱輻射照射其后趾相應(yīng)部位，記錄從照射到縮爪回避的時間，每只大鼠雙足各測5次，每次間隔5 min，取后3次的平均值即為其TWL。

6 標(biāo)本制作及處理

于注射姜黃素3 d、7 d、14 d痛閾測定后經(jīng)腹腔注射5%水合氯醛400 mg/kg麻醉動物，取6只剖胸后經(jīng)心臟插管，灌注生理鹽水200 mL，繼而灌注4%多聚甲醛400 mL，取大鼠L4～L6節(jié)段脊髓及相應(yīng)DRG，固定后石蠟包埋，切片，用于免疫組化染色。另取3只大鼠快速取L4～L6節(jié)段脊髓及相應(yīng)DRG新鮮組織，液氮中快速制冷后－80℃低溫保存，用于免疫印跡實驗。

6.1 免疫組化 組織石蠟切片經(jīng)常規(guī)脫蠟后按SP超敏二步法染色，BiPⅠ抗?jié)舛葹?∶150。中性樹脂封片顯微鏡下觀察脊髓背角和DRG組織中BiP的表達(dá)情況，染色陽性反應(yīng)為棕黃色顆粒，間隔5張順序選取脊髓背角(Ⅰ、Ⅱ板層)和DRG片子6張/只，計算脊髓背角和DRG中的陽性細(xì)胞率［陽性細(xì)胞率(%)=陽性細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%］。

6.2 免疫印跡 內(nèi)參為β－tubulin。－80℃冰箱取出新鮮組織標(biāo)本，按重量體積比1∶10加入裂解液充分研磨，超聲后靜置30 min，然后12000 r/min、4℃離心20 min，取上清液待測，BCA方法測定蛋白濃度，按照50 μg、15 mL加樣變性蛋白。經(jīng)SDS－聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后，轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，用含5%脫脂奶粉的TBST溶液封閉2 h，加入BiP多克隆抗體(兔抗大鼠，脊髓1∶1000稀釋，DRG1∶1000稀釋)，4℃過夜，室溫復(fù)溫后，TBST洗10 min×3次，加入堿性磷酸酶標(biāo)記的 IgG抗體(山羊抗兔，按1∶8000稀釋)，室溫1 h。TBST洗10 min×3次。滴加ECL發(fā)光液用MicroChemi化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)(DNR)曝光、拍照。用AlphaEaseFC軟件分析條帶吸光度。

7 統(tǒng)計學(xué)處理

結(jié) 果

1 各組大鼠體重、血糖、FINS及ISI變化情況

與C組比較，D組大鼠飼養(yǎng)8周后體重明顯增高(P＜0.05)，血糖水平較C組增高但未達(dá)到糖尿病診斷標(biāo)準(zhǔn)［(6.53±0.36)mmol/L］，而在注射STZ 3 d后明顯升高［(26.68±2.64)mmol/L］(P＜0.01)，并能持續(xù)到注射后 28 d［(27.80±2.41)mmol/L］(P ＜0.01)，見表1。

表1 C組與D組大鼠體重和血糖的比較Table 1.Comparison of weight and blood glucose between C group and D group(.n=9)

表1 C組與D組大鼠體重和血糖的比較Table 1.Comparison of weight and blood glucose between C group and D group(.n=9)

C:control;D:diabetes mellitus.*P ＜0.05 vs C group at the same time point.

)0 week C 187.9±4.6 6.36±0.44 D 183.6±7.2 6.22±0.648 weeks C 413.2±17.0 6.34±0.46 D 461.1±29.0* 6.53±0.363 d after STZ injection C 434.6±27.0 6.38±0.46 D 445.0±31.6* 26.68±2.64*28 d after STZ injection C 452.7±26.4 6.39±0.46 D 423.4±34.5* 27.80±2.41*

飼養(yǎng)8周后，D組大鼠空腹胰島素濃度較C組明顯升高(P＜0.05)，胰島素敏感指數(shù)也明顯下降(P ＜0.05)，見表2。

表2 C組與D組大鼠胰島素、胰島素敏感指數(shù)比較Table 2.Comparison of insulin level and insulin sensitivity index between C group and D group(.n=9)

表2 C組與D組大鼠胰島素、胰島素敏感指數(shù)比較Table 2.Comparison of insulin level and insulin sensitivity index between C group and D group(.n=9)

*P ＜0.05 vs C group at the same time point.

Group Insulin level(μmol/L)Insulin sensitivity index 0 week 8 weeks 0 week 8 weeks C 3.49±0.43 3.93±0.54 －2.50±0.47 －2.70±0.35 D 3.77±0.27 4.50±0.29* －2.81±0.23 －3.78±0.51*

2 痛閾變化

注射STZ 14 d后，與C組相比，DNP組、DCur組和DSC組的MWT值降低，TWL值明顯縮短(P＜0.05)，且持續(xù)至 STZ注射后28 d(P＜0.05)。與DNP組相比，DCur組給姜黃素7 d后MWT和TWL開始有升高，14 d后明顯升高(P＜0.05)。DSC組與DNP組相比差異無顯著，見表3。

3 免疫組化結(jié)果

與C組相比，DNP組大鼠在STZ注射后14 d，脊髓背角及DRG中BiP表達(dá)明顯升高(P＜0.05)，給姜黃素14 d后BiP在脊髓背角及DRG表達(dá)較DNP組有所下降(P＜0.05)，DSC組脊髓背角及DRG中BiP的表達(dá)與DNP組無顯著差異，見圖1。

4 免疫印跡結(jié)果

DNP組、DCur組和DSC組脊髓背角和DRG中BiP表達(dá)水平均較C組高(P＜0.05)。DCur組在給姜黃素7 d后BiP表達(dá)開始降低，給姜黃素14 d后，與DNP組比較可明顯降低BiP的表達(dá)(P＜0.05);DSC組脊髓背角及DRG中BiP的表達(dá)與DNP組相比無顯著差異(P＜0.05)，見圖2。

表3 大鼠各組不同時點MWT與TWL的變化Table 3.Comparison of MWT and TWL among different groups(.n=9)

表3 大鼠各組不同時點MWT與TWL的變化Table 3.Comparison of MWT and TWL among different groups(.n=9)

*P＜0.05 vs C group;#P＜0.05 vs DNP group.

14 d after curcumin injection MWT(g) C 40.6 ±3.4 39.1 ±1.5 40.6 ±4.9 42.8 ±3.3 40.4 ±6 Index Group Basic value 14 d after STZ injection 3 d after curcumin injection 7 d after curcumin injection.6 DNP 41.1 ±4.9 23.8 ±2.5* 25.7 ±2.1* 26.1 ±2.9* 27.1 ±2.3*DCur 41.1 ±5.0 24.5 ±2.7* 25.2 ±2.9* 32.2 ±3.3*# 31.7 ±3.7*#DSC 40.9 ±5.0 22.8 ±3.3* 26.3 ±1.0* 24.9 ±2.7* 26.6 ±2.4*TWL(s) C 12.67 ±2.43 12.13 ±0.90 13.86 ±3.64 11.31 ±1.30 11.34 ±1.82 DNP 12.83 ±1.52 9.79 ±1.76* 7.08 ±0.88* 7.36 ±0.32* 7.38 ±1.47*DCur 12.78 ±1.51 9.66 ±1.69* 6.62 ±0.66* 8.97 ±0.62*# 9.09 ±0.47*#DSC 12.80 ±1.50 9.38 ±1.66* 6.62 ±0.84* 8.11 ±1.19* 6.89 ±0.73*

Figure 1.BiP expression in dorsal horn and dorsal root ganglion(DRG)detected by immunohistochemisty(×400).The representative images were on the 14th day of curcumin treatment..n=6.*P＜0.05 vs C group;#P＜0.05 vs DNP group.圖1 免疫組化法檢測脊髓背角和DRG中BiP的表達(dá)

Figure 2.BiP expression in spinal cord and DRG detected by Western blotting.The representative images were on the 14th day of curcumin treatment..n=3.*P＜0.05 vs C group;#P＜0.05 vs DNP group.圖2 免疫印跡法檢測脊髓和DRG中BiP的表達(dá)

討 論

本研究結(jié)果表明，STZ誘導(dǎo)Ⅱ型DNP模型建立成功后MWT降低，TWL縮短;同時脊髓背角和DRG中BiP表達(dá)開始上調(diào);給予姜黃素治療14 d后可改善大鼠痛覺過敏的行為學(xué)表現(xiàn)，脊髓背角和DRG中BiP表達(dá)下降。

過多的糖分和脂肪攝入會導(dǎo)致肌肉、脂肪組織產(chǎn)生胰島素抵抗，另外，過多的脂肪攝入也會導(dǎo)致內(nèi)源性糖產(chǎn)生受損;也就是說高脂高糖飲食、肥胖在胰島素抵抗的誘發(fā)過程中及最終導(dǎo)致2型糖尿病的發(fā)病過程中起著重要作用［8］。STZ是糖尿病化學(xué)誘導(dǎo)劑，含有一個高度活性的葡萄糖側(cè)鏈，能使胰島β細(xì)胞對其錯誤識別而選擇性侵入β細(xì)胞，通過氧化和羥基化對β細(xì)胞發(fā)生毒性作用，誘發(fā)糖尿病，被廣泛用于制作糖尿病模型。本實驗參照Srinivasan等［6］的方法，先用高脂高糖飼料喂養(yǎng)大鼠誘導(dǎo)其胰島素抵抗的發(fā)生，再繼以小劑量STZ 35 mg/kg單次腹腔注射，破壞部分胰島β細(xì)胞功能，致使胰島代償能力減弱，加速糖尿病的發(fā)生，整個過程誘導(dǎo)出的大鼠模型其病理、生理都接近于人類2型糖尿?。?］。注射STZ 3 d后血糖升高至16.7 mmol/L以上;注射STZ 14 d后大鼠痛閾顯著降低，證明2型糖尿病神經(jīng)病理性疼痛形成并持續(xù)存在，模型制備成功。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通過激活未折疊蛋白反應(yīng)(unfolded protein response，URP)以保護(hù)由ERS所引起的細(xì)胞損傷。UPR是由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子伴侶(如BiP/GRP78、鈣聯(lián)結(jié)蛋白、GRP94等)和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上3個跨膜蛋白包括內(nèi)質(zhì)網(wǎng)類似激酶(PRKR－like endoplasmic reticulum kinase，PERK)、肌醇需求激酶 1(inosital－requiring enzyme 1，IRE1)和活化轉(zhuǎn)錄因子6(activating transcription factor 6，ATF6)所介導(dǎo)的。生理情況下這3個跨膜蛋白分別與分子伴侶GRP78/BiP結(jié)合，以維持正常非活性狀態(tài);但是應(yīng)激條件下，未折疊蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)堆積使GRP78/BiP從3種跨膜蛋白上解離［10］。ERS或URP是機(jī)體進(jìn)行功能代償和自我保護(hù)的一個過程，當(dāng)嚴(yán)重的ERS持續(xù)存在時，UPR不僅不能起到保護(hù)作用，反而會誘導(dǎo)ERS特異的轉(zhuǎn)錄分子CHOP/GADD153等表達(dá)、c－Jun氨基末端激酶(c－Jun N－terminal kinase，JNK)活化及各種caspase的激活等引起細(xì)胞包括神經(jīng)元的損傷［11］。

糖尿病狀態(tài)下高血糖、ROS、多元醇和AGEs等作為傷害性刺激信號，引起感覺神經(jīng)元胞體或軸突損傷，使脊髓背角和DRG神經(jīng)元發(fā)生可塑性改變，這種改變構(gòu)成了傷害性信號在脊髓背角異常整合的神經(jīng)生理和神經(jīng)化學(xué)基礎(chǔ)，成為神經(jīng)病理性疼痛發(fā)生發(fā)展的主要原因。在高血糖、細(xì)胞因子和炎癥趨化因子等的釋放能引起神經(jīng)結(jié)構(gòu)和功能損害［12］而導(dǎo)致蛋白質(zhì)在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)滯留，甚至誘發(fā)ERS。ERS在神經(jīng)病理性疼痛發(fā)生發(fā)展的作用尚不明確，但是ERS導(dǎo)致神經(jīng)元損傷會影響到受損神經(jīng)的恢復(fù)。在脊髓短暫性缺血模型脊髓內(nèi)有BiP等ERS相關(guān)蛋白的表達(dá)，表明BiP在短暫性缺血的脊髓神經(jīng)元損傷過程中起了重要作用［13］。而 Ling等［14］研究發(fā)現(xiàn)C6/C7椎間關(guān)節(jié)損傷模型(疼痛模型)其MWT升高的同時BiP表達(dá)也增加，進(jìn)一步證實了BiP與神經(jīng)病理性疼痛的關(guān)系。本研究發(fā)現(xiàn)正常大鼠脊髓背角和DRG中BiP表達(dá)極少，STZ誘導(dǎo)后14 d大鼠脊髓背角和DRG中BiP開始上調(diào)，28 d呈現(xiàn)高表達(dá)，此時大鼠的行為學(xué)表現(xiàn)最為顯著，提示BiP的激活與大鼠痛覺過敏的行為學(xué)表現(xiàn)呈一致性，提示激活的BiP可能參與了2型DNP的發(fā)生、發(fā)展與持續(xù)化過程。

姜黃素是從姜科姜黃屬植物姜黃根莖中提取的一種酚性色素，其色澤穩(wěn)定毒性極低。姜黃素可抑制活化蛋白1(activator protein－1，AP－1)的激活，抑制生長抑制和DNA損傷誘導(dǎo)蛋白153(growth arrestand DNA damage－inducible protein 153，GADD153)而減輕ERS，對癲癇持續(xù)狀態(tài)后海馬神經(jīng)元起保護(hù)作用。抑制氧化應(yīng)激和一氧化氮(nitric oxide，NO)的表達(dá)，減輕神經(jīng)病理性疼痛［15］。本研究用姜黃素100 mg·kg－1·d－1治療14 d 后，可有效緩解大鼠的痛閾，下調(diào)大鼠脊髓背角與DRG中BiP表達(dá)，其機(jī)制可能與姜黃素抑制BiP的激活，減輕脊髓背角和DRG神經(jīng)元損傷有關(guān)。

綜上所述，腹腔注射 100 mg·kg－1·d－1姜黃素14 d后可減輕2型DNP大鼠MWT和TWL，抑制脊髓背角和DRG中BiP表達(dá)。但由于缺乏特異性的BiP抑制劑，我們不能確定姜黃素對BiP的抑制作用是通過作用其下游分子或是直接作用于BiP。因此，我們推測2型DNP的發(fā)生與發(fā)展中有ERS相關(guān)蛋白BiP的活化，姜黃素可能是通過抑制BiP的表達(dá)減輕2型DNP大鼠的疼痛。

［1］Van Acker K，Bouhassira D，De Bacquer D，et al.Prevalence and impact on quality of life peripheral neuropathy with or without neuropathic pain in type 1 and type 2 diabetic patients attending hospital outpatients clinics［J］.Diabetes Metab，2009，35(3):206－213.

［2］Schroder M.Endoplasmic reticulum stress responses［J］.Cell Mol Life Sci，2008，65(6):862 －894.

［3］Ozcan U，Cao Q，Yilmaz M，et al.Endoplasmic reticulum stress links obesity，insulin action，and type 2 diabetes［J］.Science，2004，306(5695):457 －461.

［4］Martenson ME，Cetas JS，Heinricher MM.A possible neural basis for stress － induced hyperalgesia［J］.Pain，2009，142(3):236－244.

［5］Peeyush KT，Gireesh G，Jobin M，et al.Neuroprotective role of curcumn in the cerebellum of streptozotocin－induced diabetic rats［J］.Life Sci，2009，85(19 － 20):704－710.

［6］Srinivasan K，Viswanad B，Astrat L，et al.Combination of high fat diet fed and low dose streptozotocin treated rat:a model for type 2 diabetes and pharmacological screening［J］.Pharmacol Res，2005，52(4):313 －320.

［7］Muniyappa R，Lee S，Chen H，et al.Current approaches for assessing insulin sensitivity and resistance in vivo:advantages，limitations，and appropriate usage［J］.Am J Physiol Endocrinol Metab，2008，294(1):E15－E26.

［8］Proietto J，F(xiàn)ilippis A，Nakhla C，et al.Nutrient－ induced insulin resistance［J］.Mol Cell Endocrinol，1999，151(1－2):143－149.

［9］Deborah M，Christopher B.Molecularand metabolic mechanisms of insulin resistance and β cell failure in type 2 diabetes［J］.Nat Rev Mol Cell Biol，2008，9(3):193－205.

［10］Zhao L，Ackerman SL.Endoplasmic reticulum stress in health and disease［J］.Cur Opin in Cell Biol，2006，18(4):444－452.

［11］Oyadomari S，Araki E，Mori M.Endoplasmic reticulum stress － mediated apoptosis in pancreatic β － cells［J］.Apoptosis，2002，7(4):335 －345.

［12］Bezzi P，Domercq M，Brambilla L，et al.CXCR －4－actived astrocyte glutamate release via TNFα:amplification by microglia triggers neurotoxicity［J］.Nat Neurosci，2001，4(7):702－710.

［13］Yamauchi T，Sakurai M，Abe K，et al.Impact of the endoplasmic reticulum stress response in spinal cord after transient ischemia［J］.Brain Res，2007，1169:24 －33.

［14］Ling D，Odeleye AO，Jordan－Sciutto KL，et al.Painful facet joint injury induces neuronal stress activation in the DRG:Implications for cellular mechanisms of pain［J］.Neurosci Lett，2008，443(2):90 －94.

［15］Sharma S，Kulkarni SK，Aqrewala JN，et al.Curcumin attenuates thermal hyperalgesia in a diabetic mouse model of neuropathic pain［J］.Eur J Pharmacol，2006，536(3):256－261.