楊舒蕾,雷曉露,劉曉紅

(1.河南科技職業(yè)大學 生理學教研室,河南 周口 466000;2.遵義醫(yī)科大學 生理學教研室,貴州 遵義 563099)

神經(jīng)病理性疼痛涉及神經(jīng)元正常電活動的改變,其主要的電生理學特點是神經(jīng)元放電異常增加,超極化激活環(huán)核苷酸門控陽離子(hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated channels,HCN)通道屬孔隙環(huán)離子通道超家族成員,在哺乳動物中,HCN通道家族包括4個成員(HCN1、2、3、4),激活時產(chǎn)生的內(nèi)向Ih電流導致細胞膜去極化,興奮性增高。近年研究表明HCN通道與神經(jīng)病理性疼痛的發(fā)生密切相關(guān),HCN通道廣泛分布于傷害性感覺傳導通路,其表達和功能的變化可促進病理疼痛的產(chǎn)生[1]。脊髓是痛覺信號調(diào)制的關(guān)鍵部位,研究發(fā)現(xiàn)HCN通道表達于脊髓背角, HCN1和HCN2存在于初級傳入神經(jīng)中樞端[2-3];HCN4選擇性表達于背角抑制性中間神經(jīng)元,但在脊髓背角中未檢測到HCN3的表達[4]。最近,Hu等[5]進行大鼠脊髓薄片全細胞膜片鉗記錄時發(fā)現(xiàn),58%的脊髓膠狀質(zhì)抑制性中間神經(jīng)元可記錄到Ih電流。然而,HCN通道是如何影響脊髓背角神經(jīng)元興奮性并參與病理痛的調(diào)節(jié),目前相關(guān)研究證據(jù)尚不充分。

細胞外ATP是一種重要的疼痛信號物質(zhì),其受體分為離子通道型P2X受體和G蛋白藕聯(lián)型P2Y受體。其中,P2X(P2X1-7)受體是一種非選擇性陽離子通道,激活時允許Na+、K+和Ca2+通過,其中對Ca2+的通透性最大。P2X受體廣泛分布于各級感覺神經(jīng)元,與傷害性信息的傳遞和整合密切相關(guān)[6]。形態(tài)學及分子生物學實驗表明,多種P2X受體表達于脊髓背角,其中P2X1和P2X3主要分布于初級傳入神經(jīng)中樞端;P2X4和P2X7選擇性表達于小膠質(zhì)細胞;而P2X2、P2X5和P2X6表達于脊髓背角神經(jīng)元[7-8]。脊髓背角神經(jīng)元P2X受體的功能是否受到HCN通道影響尚不清楚。本實驗通過觀察HCN通道拮抗劑ZD7288對培養(yǎng)的脊髓背角神經(jīng)元P2X受體激活誘發(fā)的[Ca2+]i的影響,以探討HCN通道對P2X受體功能的調(diào)節(jié)作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 實驗研究動物SD成年健康大鼠所生的1～3 d乳鼠由重慶第三軍醫(yī)大學實驗動物中心提供[許可證號SCXK(渝) 2007-0005],動物實驗倫理審批編號為ZMU21-2210-008,大鼠在合適的溫度、濕度環(huán)境(干燥通風、自由飲食、晝夜光線變換)中飼養(yǎng)。

1.2 試劑與儀器 ATP、PPADS、ZD7288、8-Br-cAMP均購自美國Sigma;EDTA購自成都科龍化工試劑廠;鈣離子熒光探針Fluo-4/AM和F-127購自日本Dojindo;激光共聚焦顯微鏡(TCS SP2)為德國Leica產(chǎn)品。

1.3 脊髓背角神經(jīng)元培養(yǎng) 1～3 d 乳鼠乙醚麻醉,斷頭,在解剖顯微鏡下取出脊髓背角組織,剪碎,加0.125%胰蛋白酶,置于37 ℃含5% CO2細胞培養(yǎng)箱中孵育30 min;用含胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基終止消化,吹打成細胞混懸液,離心5 min(1 000 r/min),棄去上清液,加入適量Neurobasal/B27培養(yǎng)基重懸細胞,接種于激光共聚焦培養(yǎng)皿內(nèi)的蓋玻片(玻片預(yù)先包被多聚賴氨酸和層粘連蛋白),放入細胞培養(yǎng)箱,3 h后添加2 mL Neurobasal/B27培養(yǎng)基。接種1 d后加入阿糖胞苷(5 μmol/L,24 h)抑制膠質(zhì)細胞增殖,2～3 d用于實驗。

1.4 分組及給藥 培養(yǎng)的脊髓背角神經(jīng)元分為7組:①對照組;②ATP組(100 μmol/L);③無鈣液+ATP組(無鈣液預(yù)先孵育20 min,再加入ATP);④PPADS+ATP組(50 μmol/L PPADS預(yù)先孵育10 min,再加入ATP);⑤ ZD7288+ATP組(不同濃度1～1 000 μmol/L ZD7288預(yù)先孵育10 min,再加ATP);⑥ 8-Br-cAMP+ATP組(100 μmol/L 8-Br-cAMP孵育10 min后加ATP);⑦ ZD7288+8-Br-cAMP+ATP組(先加100 μmol/L ZD7288孵育10 min,再加8-Br-cAMP孵育10 min,最后加ATP)。

1.5 背角神經(jīng)元[Ca2+]i測定 參照孫濤等[9]的方法檢測培養(yǎng)的脊髓神經(jīng)元[Ca2+]i,大致方法如下:培養(yǎng)細胞用DMEM/F12培養(yǎng)基漂洗3次,加入Fluo-4/AM (2 μmol/L)熒光指示劑與F127的混合溶液,37 ℃細胞培養(yǎng)箱內(nèi)避光孵育30 min;漂洗后以少許DMEM/F12培養(yǎng)基覆蓋細胞,置于Leica激光共聚焦顯微鏡的載物臺上,通過Hamamatsu Ca2+檢測系統(tǒng)進行掃描檢測:掃描頻率2 s/圖,檢測5 min。用Ca2+相對熒光強度=F1/F0 (F0,靜息狀態(tài)時Ca2+熒光強度;F1,加藥后Ca2+熒光強度)反映脊髓背角神經(jīng)元[Ca2+]i的變化。

2 結(jié)果

2.1 ATP誘發(fā)脊髓背角神經(jīng)元[Ca2+]i快速升高 100 μmol/L ATP可迅速升高脊髓背角神經(jīng)元[Ca2+]i,然后緩慢下降恢復(fù)(P<0.05,圖1、2)。為了驗證ATP引起[Ca2+]i升高效應(yīng)中Ca2+的來源,加入了乙二胺四乙酸螯合孵育液中Ca2+后,ATP不再引起脊髓背角神經(jīng)元[Ca2+]i升高,說明乙二胺四乙酸螯合孵育液中的Ca2+可完全阻斷ATP增高脊髓背角神經(jīng)元[Ca2+]i,表明ATP誘導的[Ca2+]i增加是由細胞外鈣內(nèi)流引起的,無細胞內(nèi)鈣釋放參與(P<0.05,圖2、3);此外,為了清楚ATP所致的[Ca2+]i升高是通過P2X途徑還是P2Y途徑,采用P2X受體拮抗劑PPADS(P2X1、2、3、5、7特異性拮抗劑,50 μmol/L)預(yù)孵育10 min后,可基本阻斷ATP導致脊髓背角神經(jīng)元[Ca2+]i升高的效應(yīng)(P<0.05,圖2、4),說明ATP誘發(fā)的脊髓背角神經(jīng)元[Ca2+]i增加是由P2X受體介導的。

A:加100 μmol/L ATP前脊髓背角神經(jīng)元的基礎(chǔ)鈣熒光強度;B:加100 μmol/L ATP后脊髓背角神經(jīng)元的鈣熒光強度明顯增強;C:加100 μmol/L ATP后脊髓背角神經(jīng)元的鈣熒光強度曲線變化。圖1 ATP升高脊髓背角神經(jīng)元[Ca2+]i

*:與對照組相比, P<0.05;#:與ATP組相比,P<0.05;n=8。 圖2 ATP經(jīng)P2X受體引起脊髓背角神經(jīng)元[Ca2+]i升高

A:孵育液為無鈣液時加100 μmol/L ATP前脊髓背角神經(jīng)元的基礎(chǔ)熒光強度;B:孵育液為無鈣液預(yù)先孵育20 min后加100 μmol/L ATP后脊髓背角神經(jīng)元的鈣熒光強度無明顯變化;C.孵育液為無鈣液時加100 μmol/L ATP后脊髓背角神經(jīng)元的鈣熒光強度變化曲線。圖3 孵育液為無鈣液對ATP所致脊髓背角神經(jīng)元[Ca2+]i升高的影響

A:PPADS(50 μmol/L)預(yù)先孵育10 min后加100 μmol/L ATP前脊髓背角神經(jīng)元的基礎(chǔ)熒光強度;B:PPADS(50 μmol/L)預(yù)先孵育10 min后加100 μmol/L ATP后脊髓背角神經(jīng)元的基礎(chǔ)熒光強度;C:PPADS(50 μmol/L)預(yù)先孵育10 min后加100 μmol/L ATP后脊髓背角神經(jīng)元的鈣熒光強度變化曲線。圖4 P2X受體拮抗劑PPADS對ATP所致的脊髓背角神經(jīng)元[Ca2+]i升高的影響

2.2 HCN通道對脊髓背角神經(jīng)元ATP所致的[Ca2+]i升高的調(diào)節(jié)作用 1～1 000 μmol/L ZD7288對靜息狀態(tài)下脊髓背角神經(jīng)元[Ca2+]i無影響,但ZD7288(100 μL/L)預(yù)孵育10 min可顯著抑制ATP(100 μmol/L)誘導的神經(jīng)元[Ca2+]i升高。ZD7288濃度由10 μmol/L增加至100 μmol/L,1 000 μmol/L,其對ATP所致[Ca2+]i升高的抑制作用越強,呈劑量依賴性(P<0.05,圖5、6)。

A:加入100 μmol/LATP前后脊髓背角神經(jīng)元的鈣熒光強度;B～E:不同濃度ZD7288(1～1 000 μmol/L)預(yù)先孵育10 min,再加ATP前后脊髓背角神經(jīng)元的鈣熒光強度。 圖5 不同濃度ZD7288對ATP導致脊髓背角神經(jīng)元[Ca2+]i升高的影響

*:與ATP組相比,P<0.05;n=8。圖6 ZD7288抑制ATP所致的脊髓背角神經(jīng)元[Ca2+]i升高呈劑量依賴性

2.3 HCN通道拮抗劑ZD7288抑制8-Br-cAMP增強ATP所致的脊髓背角神經(jīng)元[Ca2+]i升高的效應(yīng) 8-Br-cAMP是可透過細胞膜的cAMP類似物,8-Br-cAMP(100 μmol/L)能顯著增強ATP對脊髓背角神經(jīng)元[Ca2+]i的作用;ZD7288預(yù)孵育10 min可顯著抑制8-Br-cAMP對ATP增強神經(jīng)元[Ca2+]i的作用(P<0.05,圖7、8)。

A～C:加入100 μmol/LATP前后脊髓背角神經(jīng)元的鈣熒光強度;D～F:100 μmol/L ZD7288預(yù)先孵育10 min,再加100 μmol/LATP前后脊髓背角神經(jīng)元的鈣熒光強度; G～I:100 μmol/L 8-Br-cAMP孵育10 min后加100 μmol/L ATPATP前后脊髓背角神經(jīng)元的鈣熒光強度;J～L:先加100 μmol/L ZD7288孵育10 min,再加8-Br-cAMP孵育10 min,最后加ATP前后脊髓背角神經(jīng)元的鈣熒光強度。圖7 ZD7288抑制8-Br-cAMP增強ATP升高脊髓背角神經(jīng)元[Ca2+]i的效應(yīng)

*:與ATP組相比,P<0.05;#:與8-Br-cAMP +ATP組相比,P<0.05;n=8。圖8 ZD7288抑制8-Br-cAMP增強ATP升高脊髓背角神經(jīng)元[Ca2+]i的效應(yīng)

3 討論

大量研究證實,ATP及其P2受體與病理性疼痛的發(fā)生發(fā)展密不可分,ATP在組織損傷時被釋放,與P2X和(或)P2Y受體結(jié)合可升高感覺神經(jīng)元[Ca2+]i,促進興奮性神經(jīng)遞質(zhì)的釋放,導致痛敏的產(chǎn)生[10]。本實驗研究發(fā)現(xiàn),ATP可以增高脊髓背角神經(jīng)元[Ca2+]i,P2X受體拮抗劑PPADS可阻斷此效應(yīng),說明ATP所致的[Ca2+]i升高可能是由P2X受體介導。另外,胞外Ca2+與EGTA螯合可以完全阻斷ATP對神經(jīng)元[Ca2+]i的作用,也從側(cè)面印證了ATP激活P2X受體導致細胞外Ca2+內(nèi)流,導致神經(jīng)元[Ca2+]i升高。以往的研究顯示,表達于脊髓背角神經(jīng)元的P2X受體主要有P2X2、P2X5、P2X6,其中P2X2最豐富[7,11]。本實驗PPADS(P2X1、2、 3、 5、7特異性拮抗劑)基本上能阻斷ATP引起的脊髓背角神經(jīng)元[Ca2+]i升高,也印證了前人的結(jié)果。以往研究顯示,P2X受體的功能受到PKA調(diào)節(jié)。Chow等[12]報道P2X2受體的細胞內(nèi)羧基末端含有幾個cAMP依賴的PKA共識磷酸化位點;在培養(yǎng)的背根節(jié)及脊髓背角神經(jīng)元,P2X受體的功能受到大麻素CB1受體活化所致的cAMP-PKA活性降低而抑制。本實驗?zāi)ね感詂AMP類似物8-Br-cAMP可顯著增強P2X受體激活導致的[Ca2+]i升高,表明cAMP-PKA信號通路活化可以促進脊髓背角神經(jīng)元P2X受體開放,致使[Ca2+]i升高。

以往對脊髓背角HCN通道參與病理性疼痛的研究主要集中于突觸前。Takasu等[13]發(fā)現(xiàn),鞘內(nèi)注射ZD7288可顯著抑制福爾馬林引起的炎性痛和外周神經(jīng)損傷引起的神經(jīng)痛;進一步的脊髓薄片電生理實驗中觀察到,突觸前HCN2通道促進了初級傳入纖維中樞端釋放谷氨酸,導致背角感覺神經(jīng)元興奮性增加。存在于脊髓背角神經(jīng)元的HCN通道主要為HCN4[4],近年研究發(fā)現(xiàn),局麻藥利多卡因可顯著抑制脊髓膠狀質(zhì)神經(jīng)元Ih幅度[5],治療神經(jīng)痛的藥物加巴噴丁也可抑制膠狀質(zhì)抑制性神經(jīng)元HCN4介導的Ih電流[14],推測脊髓背角HCN4通道在病理性疼痛的產(chǎn)生過程中可能發(fā)揮重要作用并有望成為疼痛治療新靶點。本研究ZD7288可顯著抑制ATP經(jīng)P2X受體引起的[Ca2+]i升高,表明脊髓背角神經(jīng)元HCN4通道的活化可促進嘌呤能P2X受體開放,導致背角感覺神經(jīng)元興奮性水平增高。此外,ZD7288可抑制8-Br-cAMP增強ATP升高脊髓背角神經(jīng)元[Ca2+]i的效應(yīng),由此推測HCN通道可能是通過增強背角神經(jīng)元cAMP-PKA的活性而促進P2X受體的開放。先前的研究也表明,HCN通道功能的改變可以調(diào)節(jié)cAMP-PKA的活性。中腦導水管周圍灰質(zhì)腹外側(cè)區(qū)(vlPAG)局部注射ZD7288可降低慢性坐骨神經(jīng)損傷大鼠vlPAG 區(qū)cAMP含量及神經(jīng)元動作電位發(fā)放頻率的增加[15];ZD7288可顯著抑制8-Br-cAMP增強谷氨酸誘發(fā)海馬神經(jīng)元[Ca2+]i升高的效應(yīng)[16];鞘內(nèi)給予ZD7288可降低糖尿病周圍神經(jīng)痛大鼠脊髓背角cAMP含量的增加[17]。

HCN通道如何影響cAMP-PKA活性?目前的研究顯示,HCN通道的開放可升高細胞[Ca2+]i,進一步激活Ca2+鈣調(diào)蛋白依賴性腺苷酸環(huán)化酶,導致胞內(nèi)cAMP濃度升高,PKA活化[18]。關(guān)于HCN通道激活導致細胞[Ca2+]i升高,從現(xiàn)有的文獻來看,可能主要是因為:HCN通道開放產(chǎn)生的內(nèi)向電流引起細胞膜去極化,導致膜電壓依賴鈣通道打開,細胞外Ca2+流入,[Ca2+]i增加[2,17]。比如,Felix等[19]發(fā)現(xiàn)HCN通道拮抗劑ZD7288可阻斷小鼠精原細胞以及HEK-293細胞的T型電壓依賴性鈣通道電流。此外,近年有研究認為HCN通道開放后,除了Na+內(nèi)流、K+外流,對Ca2+也具通透性,存在Ca2+內(nèi)流。在脊髓背角神經(jīng)元,HCN通道開放引起的去極化是否激活電壓依賴性鈣通道,有待于進一步證實。

由此可見,病理性疼痛時脊髓背角感覺神經(jīng)元HCN通道表達增加可能引起胞內(nèi)cAMP-PKA信號通路的激活,進而促進嘌呤能P2X受體的激活,導致脊髓背角感覺神經(jīng)元興奮性增加,促進了病理性疼痛的發(fā)生與發(fā)展。

綜上所述,本研究結(jié)果顯示HCN通道可通過改變cAMP-PKA活性而調(diào)節(jié)脊髓背角神經(jīng)元P2X受體的功能。在炎性損傷或神經(jīng)損傷時,背角神經(jīng)元 HCN通道激活,通過增強胞內(nèi)cAMP-PKA活性而促進嘌呤能P2X受體活化,導致脊髓背角感覺神經(jīng)元興奮性增加,這可能是HCN通道參與脊髓水平疼痛調(diào)節(jié)的重要機制。