維生素E對先天性膈疝大鼠模型胎仔肺發(fā)育及肺血管重構(gòu)的影響

林 涵，王鑾虹，劉文英，王學(xué)軍，吉 毅，楊 綱

(1.汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院小兒外科，廣東 汕頭 515041;2.汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬腫瘤醫(yī)院婦瘤科，廣東 汕頭 515031;3.四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院·四川省人民醫(yī)院兒童醫(yī)學(xué)中心，四川 成都 610072)

經(jīng)過多年的努力，先天性膈疝(congenital diaphragmatic hernia，CDH)患兒的病死率仍然高達(dá)50%，其死亡的主要原因是肺發(fā)育不成熟(pulmonary hypoplasia，PH)和持續(xù)性肺血管高壓(persistent pulmonary hypertension，PPH)。如何通過產(chǎn)前干預(yù)或者預(yù)防的方法，促進(jìn)患兒的肺發(fā)育和改善其肺血管重構(gòu)是提高該病存活率的關(guān)鍵。

1 材料與方法

1.1 模型建立與動(dòng)物分組 汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供的成年健康SD雌鼠20只，平均體重(248±11.5)g和6 只雄鼠平均體重(279±3.2)g ，2∶1夜間進(jìn)行交配，次晨取陰道內(nèi)容物涂片，以鏡下檢測到精子確定為妊娠，并以當(dāng)日為妊娠第0.5 d計(jì)算妊娠時(shí)間，交配后共18只大鼠懷孕。孕9.5 d采用成組設(shè)計(jì)將孕鼠用簡單隨機(jī)法分為3組:對照組、膈疝組和干預(yù)組(各6只)。膈疝組和干預(yù)組給予除草醚(浙江化工二廠)125 mg/只(溶于2 ml橄欖油)灌胃;對照組給予等量橄欖油。至孕11.5 d，干預(yù)組在孕11 d給予維生素E(美國Sigma公司)140 mg/kg(溶于2 ml酒精)灌胃(1次/天，連續(xù)3天)，在維生素E服用過程中采用避光措施。膈疝組和干預(yù)組給予等量酒精。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本采集及膈疝觀察 雌鼠孕21 d在戊巴比妥(0.03 mg/g)麻醉下剖宮取出胎鼠，在電子分析天平上稱重量記錄體重后處死，經(jīng)胸骨正中切口剖胸，取出兩側(cè)肺組織在電子天平上稱重后在放大鏡(4倍)下觀察有無膈肌缺損，記錄胎鼠膈疝的位置、疝孔大小和疝內(nèi)容物。計(jì)算胎鼠肺重與體重之比(Lw/Bw)。

1.2.2 光鏡標(biāo)本制定及觀察 取出胎肺用10%甲醛溶液固定，48 h后常規(guī)石蠟包埋，切片后行HE及彈力纖維染色，進(jìn)行組織學(xué)觀察(Nikon E600圖像分析顯微鏡)。

1.2.3 組織學(xué)切片圖像分析 應(yīng)用spot V3.0圖像采集軟件和image-pro plus V4.10專業(yè)圖像分析軟件測定每個(gè)視野肺組織灰度值百分比［1］，反映肺泡與肺泡腔面積的百分比-肺泡面積比(PAA%)、肺泡間隔面積比(ASA%)及軸向腺泡計(jì)數(shù)(axial acinar count，RAC)。分別計(jì)算每個(gè)切片單位面積內(nèi)腺泡前動(dòng)脈(PAPA)和腺泡內(nèi)動(dòng)脈(intra-acine pulmonary arteries，IAPA)總數(shù)，分別測量計(jì)算其平均血管外徑(ED)及平均中膜厚度百分比(MT%)。并計(jì)算肌型動(dòng)脈(MA)、部分肌型動(dòng)脈(PMA)、非肌型動(dòng)脈(NMA)的數(shù)目及其所占的百分比。以上測定均用雙盲法由同一操作者在×400倍光鏡下完成。在取標(biāo)本時(shí)，以相應(yīng)光鏡檢測表明取材較理想者各組取3個(gè)標(biāo)本作電鏡檢測，擬作電鏡觀察的肺標(biāo)本用3.0%戊二醛固定48 h后備檢。電鏡觀察使用日立H-600IV型透射電子顯微鏡觀察及照相。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，數(shù)據(jù)經(jīng)方差齊性檢驗(yàn)后，膈疝組和干預(yù)組致畸率的比較采用四格表資料率的比較的χ2檢驗(yàn)。對各實(shí)驗(yàn)組的肺重/體重應(yīng)用成組設(shè)計(jì)的秩和檢驗(yàn)(方差不齊)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，并以Nemenyi法進(jìn)行兩兩比較。其余指標(biāo)參數(shù)檢驗(yàn)方差齊性之后，采用成組設(shè)計(jì)的多個(gè)樣本均數(shù)比較的單因素方差分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)比較，組間兩兩比較采用LSD檢驗(yàn)法。各組間比較采用Student-Newman-Keuls法進(jìn)行檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般情況 對照組獲得胎仔42只，無膈疝形成。膈疝組獲得胎仔39只，有膈疝形成者26只，致畸率66.67%。干預(yù)組產(chǎn)胎仔41只，有膈疝形成者19只，致畸率46.34%。膈疝組和干預(yù)組的致畸率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。膈肌缺損多位于左側(cè)，疝內(nèi)容物主要為小腸、胃和肝臟。

2.2 光鏡觀察

2.2.1 Lw/Bw和肺發(fā)育的形態(tài)學(xué)指標(biāo) Lw/Bw、軸向腺泡計(jì)數(shù)(RAC)、肺泡面積比例(Alveoli%)、肺泡面積比(PAA%)及肺泡間隔面積比(ASA%)等體現(xiàn)肺發(fā)育不良的形態(tài)學(xué)指標(biāo)測定結(jié)果表明，維生素E能有效地改善肺組織發(fā)育，并增加肺重量/體重比值(mg/g)，與膈疝組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表1。

表1 各組Lw/Bw(mg/g)和肺實(shí)質(zhì)發(fā)育的形態(tài)學(xué)指標(biāo)比較

2.2.2 HE染色肺形態(tài)觀察 對照組肺泡結(jié)構(gòu)明顯，腺泡大，肺泡間質(zhì)薄而均勻，呼吸性支氣管末端呈囊泡狀，肺小血管管壁菲薄，管腔大，中膜平滑肌細(xì)胞呈梭形，肌層肺組織發(fā)育成熟或接近成熟，整體外觀呈肺泡期的肺形態(tài)。膈疝組肺泡小而少，間質(zhì)厚，支氣管末端囊泡狀結(jié)構(gòu)少見，肺小血管管壁明顯增厚，血管腔狹窄，中膜平滑肌細(xì)胞增生，肌層肥厚，肺組織發(fā)育停滯于假腺體期。干預(yù)組均肺泡增大，肺泡間質(zhì)變薄，肺小血管壁變薄，血管腔變大，介于兩者之間，肺組織發(fā)育處于腺泡早期。

2.2.3 肺血管的改變 MT%的變化:膈疝組的MT%與對照組比較明顯升高，其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。維生素E可使除草醚引起膈疝的胎鼠之IAPA(肺腺泡內(nèi)動(dòng)脈)的MT%(中膜厚度)降低，差異有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表2、圖1。

表2 各組胎肺間質(zhì)血管形態(tài)指標(biāo)比較 (%)

2.3 電鏡觀察 與對照組相比，膈疝組的IAPA的內(nèi)皮細(xì)胞變性肥大，平滑肌增生和膠原纖維顯著增加;干預(yù)組的IAPA的內(nèi)皮細(xì)胞輕度變性，平滑肌輕度增生，成纖維細(xì)胞增生明顯，膠原纖維增加，見圖2。

圖1 肺腺泡內(nèi)動(dòng)脈MT%的變化 a:對照組，b:膈疝組，c:干預(yù)組;圖2 胎鼠肺組織切片電鏡觀察EM×12000 a:對照組，b:膈疝組，c:干預(yù)組

3 討論

目前CDH尚缺乏有效的病因治療，CDH患兒死亡率高的主要原因是PH和PH［1，2］。PH和PPH在胚胎期已經(jīng)發(fā)生，生后繼續(xù)發(fā)育改善的能力有限，各種生后治療手段也不能很好地改善肺發(fā)育不成熟和肺血管高壓，因此目前研究的熱點(diǎn)之一聚焦在如何通過產(chǎn)前用藥改善胎肺發(fā)育上。糖皮質(zhì)激素已被應(yīng)用于PH的產(chǎn)前治療，但其可干擾母體的內(nèi)分泌系統(tǒng)并可能導(dǎo)致流產(chǎn)。故探索其他可能產(chǎn)前改善肺發(fā)育和肺血管重構(gòu)的藥物對CDH的治療有重大意義。

維生素E是最主要的抗氧化劑之一，可保護(hù)其他易被氧化的物質(zhì)，減少過氧化脂質(zhì)的生成，保護(hù)機(jī)體細(xì)胞免受自由基的毒害，抑制脂質(zhì)過氧化及形成自由基。機(jī)體在正常代謝過程中產(chǎn)生一定量的自由基，同時(shí)機(jī)體內(nèi)存在著抗氧化作用的自由基清除劑如維生素E、C和硒等，正常情況下，兩者呈動(dòng)態(tài)平衡。當(dāng)自由基產(chǎn)生過多或者抗氧化劑不足，此平衡系統(tǒng)失衡，都會(huì)導(dǎo)致機(jī)體發(fā)生疾病。如果自由基沒有及時(shí)被抗氧化劑清除，就會(huì)與距其最近的脂肪、蛋白、碳水化合物RNA或者DNA等產(chǎn)生反應(yīng)，改變它們的結(jié)構(gòu)和功能［3］，導(dǎo)致機(jī)體產(chǎn)生疾病。維生素E能維持生物膜完整性和穩(wěn)定性，有抗炎和增強(qiáng)免疫作用，能保護(hù)體內(nèi)易被氧化的物質(zhì)，提高紅細(xì)胞膜、溶酶體膜的穩(wěn)定性，維持和促進(jìn)免疫細(xì)胞的正常功能，目前已被大量應(yīng)用于治療動(dòng)脈粥樣硬化和缺血性心臟病［4～6］。本實(shí)驗(yàn)采用維生素E對大鼠CDH模型進(jìn)行產(chǎn)前干預(yù)并觀察其療效。

本實(shí)驗(yàn)采用除草醚誘導(dǎo)先天性膈疝大鼠模型，致畸率達(dá)50.70%，HE染色發(fā)現(xiàn)正常對照組外觀呈肺泡期的肺形態(tài)，而膈疝組肺組織發(fā)育停滯于假腺體期，肺泡小而且數(shù)量少，肺泡間隔厚，肺實(shí)質(zhì)呈假腺體樣改變。干預(yù)組的肺組織發(fā)育處于腺泡早期。體現(xiàn)肺發(fā)育成熟的指標(biāo)表明膈疝組肺發(fā)育不良，干預(yù)組的肺發(fā)育程度明顯改善，表明維生素E能有效地改善肺發(fā)育不良。

IAPA系呼吸性細(xì)支氣管至肺泡隔毛細(xì)血管前這一段肺動(dòng)脈的總稱，它包括MA、PMA、NMA三種不同的血管段，泡內(nèi)肺動(dòng)脈對血液灌注和阻力具有很大的緩沖能力，是控制肺動(dòng)脈血流動(dòng)力學(xué)的關(guān)鍵血管。近年來，有關(guān)肺腺泡內(nèi)動(dòng)脈構(gòu)形重建與肺動(dòng)脈高壓形成之間的關(guān)系日益受到重視［7］。人類和大鼠膈疝肺血管高壓的病理基礎(chǔ)主要是肺血管橫斷面積減少，血管內(nèi)側(cè)壁增厚和腺泡內(nèi)動(dòng)脈異常肌化［8～10］。本實(shí)驗(yàn)中，膈疝組胎鼠 IAPA的 MT與對照組比較明顯增厚，表明其血管內(nèi)側(cè)壁增厚和腺泡內(nèi)動(dòng)脈異常肌化。而在干預(yù)組中，肺腺泡內(nèi)動(dòng)脈的MT明顯下降。維生素E可能主要通過抑制肺小動(dòng)脈特別是IAPA的肌化減輕肺動(dòng)脈高壓。

本實(shí)驗(yàn)表明維生素E能改善先天性膈疝的肺發(fā)育不良及肺血管重構(gòu)，目前其作用的機(jī)制尚不清楚，可能與其清除自由基的作用有關(guān)。目前臨床上維生素E在推薦劑量下還未發(fā)現(xiàn)有明確的副作用，而維生素E在本實(shí)驗(yàn)的使用過程中，未發(fā)現(xiàn)服用的孕鼠有明確的不適癥狀。故在不影響效果的條件下，產(chǎn)前使用維生素E也許可以作為將來治療先天性膈疝肺發(fā)育不良及肺血管重構(gòu)的一種選擇。

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