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      低硒大鼠心肌線粒體硫氧還蛋白2的動態(tài)表達和心肌的損傷情況*

      2012-08-02 06:26:42潘曉青
      中國病理生理雜志 2012年12期
      關(guān)鍵詞:孵育心肌細胞線粒體

      潘曉青,魏 瑾,張 明,林 琳,單 虎,閆 蕊,賀 樂

      (西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院心內(nèi)科,陜西 西安 710004)

      硫氧還蛋白(thioredoxin,Trx)系統(tǒng)由 Trx、Trx還原酶(thioredoxin reductase,TrxR)和還原型輔酶Ⅱ(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate,NADPH)組成。Trx主要分為Trx1和Trx2。目前對該系統(tǒng)中TrxR和Trx1的研究已經(jīng)相當(dāng)廣泛,對Trx2功能的研究相對較少。已有研究顯示,它除了具有Trx家族基本的抗氧化應(yīng)激作用外,還有保護內(nèi)皮細胞、調(diào)節(jié)基因表達及促進細胞增殖等作用[1-3]。Trx2是存在于線粒體中的分子量12 kD的小分子蛋白,2000年P(guān)owis等[4]通過 Western blotting證實了 Trx2的線粒體定位。因其特異存在于線粒體又被稱為線粒體型硫氧還蛋白。Trx2是線粒體內(nèi)膜蛋白中清除活性氧簇的主要蛋白,在維持細胞存活、降低氧化應(yīng)激以及調(diào)節(jié)線粒體細胞凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中起重要作用[5]。有研究顯示低硒及冰泳刺激等因素可影響Trx系統(tǒng)的表達[6]。但是低硒對特異存在于線粒體的Trx2蛋白表達的影響及Trx2對心肌細胞損傷的影響尚不清楚。本實驗擬對該問題作進一步研究。

      材料和方法

      1 主要試劑

      心肌線粒體提取試劑盒購自北京寶賽;Trx2兔抗鼠多克隆抗體購自Proteintech;Fas相關(guān)死亡結(jié)構(gòu)域蛋白(Fas-associated death domain protein,F(xiàn)ADD)兔抗鼠多克隆抗體購自Bioss;辣根酶標(biāo)記山羊抗兔IgG(H+L)和超敏發(fā)光液購自Pierce Biotechnology,SP染色試劑盒和DAB顯色試劑盒均購自北京中杉金橋公司。

      2 動物

      將36只2周齡SD大鼠隨機分成低硒(low selenium,LS)組及對照(normal control,NC)組,每組18只(雌雄比例相同),低硒組以人工合成低硒酵母飼料喂養(yǎng)(硒含量0.01 mg/kg),對照組以本校實驗動物中心提供的常規(guī)飼料喂養(yǎng)(硒含量0.1~0.3 mg/kg)。

      3 主要方法

      3.1 在體心功能檢測 分別于第20周、30周及40周時進行,每個時點各選6只大鼠(雌雄比例相同,實驗前禁食12 h),20%烏拉坦(5 mL/kg)腹腔麻醉后,把大鼠仰臥固定于動物臺上,連接導(dǎo)管與壓力傳感器,計算機上校準(zhǔn)基線。分離一側(cè)頸動脈,在頸動脈上剪一斜口,將動脈插管經(jīng)該斜口送達左心室。固定動脈導(dǎo)管,穩(wěn)定10 min,記錄的主要指標(biāo)有:左心室峰值收縮壓(left ventricular systolic pressure,LVSP)、左心室舒張末壓(left ventricular end diastolic pressure,LVEDP)、左心室內(nèi)壓最大上升和下降速率(maximum rate of left ventricular pressure rise/decay,±dp/dtmax)。取10組連續(xù)穩(wěn)定的數(shù)據(jù),以Chart 5 for Windows軟件進行分析。

      心功能測量完畢后,麻醉狀態(tài)下快速取心臟。用刀片切取1塊大小約(3~5)mm×(3~5)mm×(10~15)mm的心肌組織,置于4%多聚甲醛中固定24 h后包埋成石蠟標(biāo)本,用于免疫組化染色。另取約200 mg心肌組織,按線粒體提取試劑盒的說明提取心肌線粒體。

      3.2 蛋白質(zhì)免疫印跡(Western blotting) 用RIPA裂解液提取線粒體蛋白,超微量紫外分光光度儀對提取的蛋白進行定量后行Western blotting檢測,每梳孔上樣量30 μg,凝膠電泳分離后半干轉(zhuǎn)移法轉(zhuǎn)到PVDF膜上。Trx2的轉(zhuǎn)膜條件為恒流1 mA/cm2膜面積,轉(zhuǎn)膜時間20 min。電壓依賴性陰離子通道1(voltage-dependent anion channel 1,VDAC1)轉(zhuǎn)膜條件為恒流 2 mA/cm2膜面積,轉(zhuǎn)膜時間 45 min。50 g/L脫脂奶粉封閉后加Ⅰ抗,Ⅰ抗孵育濃度為Trx2(1∶500),VDAC1(1∶800),孵育條件為 4 ℃ 過夜。以VDAC1作為內(nèi)參照[7]。洗膜后加Ⅱ抗室溫孵育2 h,PBST洗膜5 min×6次,用ECL顯色并分析。

      3.3 免疫組織化學(xué)法檢測FADD的表達 采用免疫組化SP法,石蠟標(biāo)本切片后常規(guī)脫蠟至水,抗原修復(fù)后滴加3%H2O2消除過氧化物酶。正常山羊血清封閉37℃15 min后,將FADDⅠ抗以1∶50稀釋,4℃孵育過夜;復(fù)溫20分鐘,PBS浸洗。Ⅱ抗37℃孵育20 min,PBS浸洗;Ⅲ抗37℃孵育20 min,PBS洗5 min,3次。DAB顯色,蘇木素襯染,封片。設(shè)置對照組,用PBS代替Ⅰ抗作為陰性對照,其它步驟相同。光學(xué)顯微鏡進行圖片分析。結(jié)果判定:以細胞漿內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性判斷標(biāo)準(zhǔn)。每張切片觀察3個高倍(×400)視野,每個視野連續(xù)數(shù)100個細胞,其中陽性細胞數(shù)與總細胞百分比即為陽性細胞指數(shù)。

      4 統(tǒng)計學(xué)處理

      結(jié) 果

      1 低硒大鼠心肌線粒體Trx2蛋白表達結(jié)果

      NC組大鼠在20周、30周及40周時,其心肌線粒體Trx2蛋白的表達水平無明顯變化(P>0.05);LS組20周時其心肌線粒體Trx2蛋白的表達水平已明顯低于相應(yīng)時段NC組大鼠,隨著喂養(yǎng)時間延長,該組大鼠心肌線粒體Trx2蛋白表達的降低程度更為明顯,經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析,30周時明顯低于相應(yīng)時點NC組,亦明顯低于20周的LS組,40周時明顯低于相應(yīng)時點NC組,亦明顯低于20周及30周的LS組(均P<0.05),見圖 1。

      2 在體心功能檢測結(jié)果

      如表1所示,低硒喂養(yǎng)20周時,LVSP及+dp/dtmax已出現(xiàn)明顯降低,而 LVEDP及-dp/dtmax與NC組比較無明顯差異。30周、40周時,LS組收縮功能與舒張功能均較NC組減低;LS組隨低硒喂養(yǎng)時間延長,LVSP及+dp/dtmax減低更為明顯,30周 與20周、40周與30周及40周與20周 組間兩兩比較,差異均顯著 (P<0.05)。

      Figure1.The expression level of Trx2 protein at different time points.NC:normal control;LS:low selenium;VDAC1:voltage-dependent anion channel 1,as an internal control..n=6.*P<0.05 vs NC group at the same time point;△P <0.05 vs LS group at 20 weeks;#P <0.05 vs LS group at 30 weeks.圖1 不同時點Trx2蛋白的表達水平

      表1 不同喂養(yǎng)時間大鼠在體心功能測定結(jié)果Table 1.The results of in vivo cardiac function of rats at different time points(.n=6)

      表1 不同喂養(yǎng)時間大鼠在體心功能測定結(jié)果Table 1.The results of in vivo cardiac function of rats at different time points(.n=6)

      NC:normal control;LS:low selenium.*P <0.05 vs NC group at the same time point;△P <0.05 vs LS group at 20 weeks;#P <0.05 vs LS group at 30 weeks.

      Time(week) Group LVSP(mmHg) LVEDP(mmHg) +dp/dtmax(mmHg/s) -dp/dtmax(mmHg/s)20 NC 130.30 ±3.72 -1.38 ±0.33 10430.00 ±808.567645.60 ±962.46 LS 113.30 ±2.21* -2.72 ±2.07 7366.10 ±455.61* 6851.03 ±654.3430 NC 118.97 ±5.31 1.43 ±2.51 8582.62 ±621.14 6255.50 ±728.67 LS 103.82 ±5.24*△ -2.82 ±1.63* 6160.68 ±402.17*△ 4982.80 ±613.21*40 NC 120.08 ±3.29 -0.92 ±1.59 8295.88 ±1318.29 6523.60 ±708.93 LS 97.74 ±2.87*△# -2.88 ±1.18* 5381.21 ±646.72*△# 3863.32 ±348.00*

      3 心肌細胞凋亡情況的免疫組化結(jié)果

      采用SP法染色,細胞內(nèi)出現(xiàn)棕色顆粒視為凋亡陽性細胞。由圖2可見,NC組棕色細胞較少,而LS組棕色細胞較多。經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析,NC組間對比未見明顯差異(P>0.05),LS組與相應(yīng)時段NC組相比,差異均顯著;LS各組間(30周與20周、40周與30周、40周與20周)相比,均有顯著差異(P<0.05)。

      4 Trx2與心功能及心肌細胞凋亡指數(shù)之間的相關(guān)性分析

      K-S法正態(tài)性檢驗顯示,Trx2、LVSP和+dp/dtmax的P值均大于0.05,可視為近似正態(tài)分布資料,而心肌細胞凋亡指數(shù)數(shù)據(jù)為偏態(tài)分布。相關(guān)性分析結(jié)果為,Trx2與 LVSP的相關(guān)系數(shù)為0.872(P<0.01),見圖 3;Trx2與 +dp/dtmax的相關(guān)系數(shù)為0.822(P<0.01),見圖4。Trx2與凋亡細胞指數(shù)的相關(guān)系數(shù)為 -0.858(P <0.01),見圖5。

      討 論

      Figure2.The immunohistochemical results of apoptosis of myocardial cells in rats at different time points(SP,×400).NC:normal control;LS:low selenium..n=6.*P < 0.05 vs NC group at the same time point;△P <0.05 vs LS group at 20 weeks;#P <0.05 vs LS group at 30 weeks.圖2 不同時間點大鼠心肌組織中細胞凋亡免疫組化染色結(jié)果

      Figure3.Correlation between mitochondrial Trx2 expression and LVSP of rats.圖3 大鼠心肌線粒體Trx2表達量與LVSP的相關(guān)性

      Figure4.Correlation between mitochondrial Trx2 expression and+dp/dtmaxof rats.圖4 大鼠心肌線粒體Trx2表達量與+dp/dtmax的相關(guān)性

      Figure5.Correlation between mitochondrial Trx2 expression and apoptotic index of myocardial cells in rats.圖5 大鼠心肌線粒體Trx2表達量與心肌細胞凋亡指數(shù)的相關(guān)性

      Trx2的基本功能為抗氧化應(yīng)激和抗凋亡作用,為了解Trx2在心肌細胞線粒體表達的動態(tài)變化及其對心肌細胞損傷的影響,本實驗在前期低硒大鼠蛋白質(zhì)組學(xué)研究的基礎(chǔ)上,完成了低硒大鼠心肌線粒體中Trx2表達的動態(tài)變化及其在心肌細胞損傷中的作用研究,并對Trx2抗凋亡機制進行初步探討。

      張在香等[8]在觀察低硒大鼠不同組織硒蛋白利用硒的優(yōu)先性研究中,發(fā)現(xiàn)20周后才能明確觀察到低硒對硒敏感蛋白的影響,其低硒大鼠造模時間為20周,為此,本研究參照該研究,從低硒喂養(yǎng)20周開始觀察。在我們的研究中,大鼠低硒喂養(yǎng)20周時,與NC組相比,其Trx2蛋白表達已出現(xiàn)明顯降低。隨著喂養(yǎng)時間的延長,Trx2表達降低更明顯。這與滕宗艷等[6]的研究結(jié)果相一致,他們低硒喂養(yǎng)大鼠14周,冰泳刺激5 min后用Western blotting法測大鼠心肌TrxR及Trx表達,發(fā)現(xiàn)常硒冰泳組TrxR及Trx蛋白表達增高。與常硒組相比,低硒冰泳組TrxR及Trx蛋白表達降低而血中脂質(zhì)過氧化物含量增高。因此他們認(rèn)為低硒條件下心肌Trx系統(tǒng)功能降低,遇到冰泳負荷時心肌不能及時清除過剩的自由基及修復(fù)損傷的蛋白,使心肌易受損傷。蔡成等[9]研究了Trx2對高氧肺損傷線粒體的保護作用,發(fā)現(xiàn)人肺腺癌A549細胞在高氧環(huán)境暴露48 h后,細胞線粒體中Trx2的mRNA表達和蛋白表達均減弱,A549細胞出現(xiàn)凋亡甚至損傷致死。這種變化表明Trx2表達減弱時對高氧肺損傷的線粒體的保護作用亦減弱。張超英等[10]對低硒與大鼠心肌組織脂質(zhì)過氧化及心肌細胞損傷關(guān)系的研究顯示,在12周時低硒組大鼠心肌組織中脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物丙二醛較加硒組顯著為高,低硒組心肌凋亡細胞檢出率為87.5%也明顯高于加硒組(檢出率25.0%)。在本實驗中,低硒組大鼠心臟收縮及舒張功能均降低,心肌細胞出現(xiàn)明顯凋亡,而Trx2的表達量與LVSP和+dp/dtmax呈正相關(guān),與心肌細胞凋亡指數(shù)呈負相關(guān)(P<0.01)。

      根據(jù)已有研究,分析本實驗Trx2表達下降的原因可能為:(1)線粒體通過氧化磷酸化過程為細胞提供ATP的同時產(chǎn)生活性氧(reactive oxygen species,ROS),是生理狀態(tài)下ROS產(chǎn)生的主要來源。低硒時含硒酶及有關(guān)蛋白合成減少,ROS清除不足,線粒體功能受損,ATP供應(yīng)不足,導(dǎo)致Trx2蛋白合成減少;(2)氧化應(yīng)激等因素可使氧化型Trx2增加,氧化型的Trx2更易被降解。Zhang等[11]研究認(rèn)為氧化型的Trx2的降解可能由線粒體基質(zhì)內(nèi)Lon蛋白酶執(zhí)行的,Lon蛋白酶是2002年才被發(fā)現(xiàn)的位于線粒體基質(zhì)負責(zé)蛋白質(zhì)量控制的酶,它的作用是把體內(nèi)損壞的蛋白質(zhì)分解并清除掉。Trx2的降解使線粒體抗氧化系統(tǒng)的主要蛋白Trx2減少,其結(jié)果導(dǎo)致細胞氧化損傷進一步加重,如此形成惡性循環(huán)。對于Trx2抗凋亡機制,Tanaka等[11]的實驗顯示Trx2與細胞色素C(cytochrome C,CytC)發(fā)生了免疫共沉淀反應(yīng),認(rèn)為Trx2通過與線粒體基質(zhì)中的促凋亡蛋白CytC錨定,二者形成復(fù)合物,通過抑制凋亡信號的傳遞而抑制細胞凋亡。而Trx2是否與CytC結(jié)合發(fā)揮抗凋亡作用尚有爭議,還需進一步研究。

      目前針對Trx2的研究大多數(shù)是從組織或細胞水平提取該蛋白來進行的,由于Trx2僅特異性表達于線粒體,為避免細胞內(nèi)其它非特異性蛋白的干擾,提高樣品蛋白中Trx2的豐度,使所得結(jié)果更加可靠,本研究首次采用了先純化心肌線粒體,在此基礎(chǔ)上提取線粒體蛋白來進行相關(guān)指標(biāo)的測定,實踐證明該方法是可行且可靠的。

      [1]潘曉青,魏 瑾.硫氧還蛋白2的研究進展[J].醫(yī)學(xué)綜述,2012,18(5):671 -674.

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