張珠明，汪仁莉，趙德明

（1.寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院動(dòng)物科學(xué)系，寧夏 銀川750021；2.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院 國家動(dòng)物海綿狀腦病實(shí)驗(yàn)室，北京 海淀100193）

世界衛(wèi)生組織曾預(yù)言，到2040年，最常見的致死性疾病中，神經(jīng)退行性疾病將會(huì)攀升至第二位，僅次于癌癥。在這類疾病中，朊病毒病是惟一能通過動(dòng)物模型直接探尋體內(nèi)病理學(xué)機(jī)理的一種。朊病毒病是由朊病毒引起人和動(dòng)物出現(xiàn)以中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性病變?yōu)樘卣鞯囊活惣膊?，主要包括人的庫魯病、克雅氏病、致死性家族性失眠，牛的海綿狀腦病、綿羊和山羊的癢病、鹿科動(dòng)物的慢性消耗性疾病等等。目前認(rèn)為該類疾病的病原朊病毒是一種不含核酸的蛋白顆粒，是機(jī)體內(nèi)正常朊蛋白PrPC發(fā)生構(gòu)象轉(zhuǎn)化錯(cuò)誤折疊形成的異常朊蛋白PrPSc。朊病毒在形態(tài)上是一種蛋白聚集物，感染機(jī)體后，不能被體內(nèi)的蛋白酶消化清除，也不會(huì)引起機(jī)體的免疫反應(yīng)和炎癥反應(yīng)，因此不易早期發(fā)現(xiàn)和進(jìn)行治療。多年來，研究朊病毒病的科學(xué)家們一直致力于該病的發(fā)病機(jī)制和治療方面的研究，希望通過體外或體內(nèi)試驗(yàn)找出抑制朊病毒轉(zhuǎn)化、增殖或轉(zhuǎn)移的方法，但仍然沒有一種藥物足夠有效地預(yù)防和治療這類疾病。朊病毒在機(jī)體內(nèi)復(fù)制的分子基礎(chǔ)是PrPC與PrPSc間構(gòu)象轉(zhuǎn)化，故而阻斷PrPC向著PrPSc轉(zhuǎn)化是朊病毒病治療的一個(gè)切入點(diǎn)。此外，朊病毒病主要特征是朊病毒在中樞神經(jīng)系統(tǒng)聚集，引起患病個(gè)體腦組織的病理變化，因此，減少PrPSc的蓄積也是治療過程中經(jīng)?？紤]到的另外一個(gè)方面。故而，用于治療的藥物如果能夠突破血腦屏障（brain－blood barrier，BBB）進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)（centre nerves system，CNS），或者直接將藥物引入到腦脊液（cerebrospinal fluid，CSF）或腦組織，從這兩個(gè)方面入手都有可能起到延緩疾病發(fā)生的作用。目前為止，在朊病毒病的治療方面取得的進(jìn)展主要有以下幾點(diǎn)。

1 化學(xué)治療

化學(xué)治療常常使用一些具有抗朊病毒作用的化合物，包括聚陰離子化合物硫酸肝素、粘多糖以及粘多糖類似物剛果紅、四環(huán)類化合物（如四環(huán)素，強(qiáng)力霉素）、多烯類抗生素（如兩性霉素B）、阻斷β－折疊形成的多肽類（如小鼠或倉鼠的朊蛋白多肽PrP119－136）等［1］。環(huán)己二胺四乙酸二鈣鈉能通過螯合感染 M1000的Balb／c小鼠腦內(nèi)的 Mn2＋進(jìn)而減少PrPSc的含量［2］。羥乙基哌嗪乙硫磺酸的體外試驗(yàn)中，對(duì)感染朊病毒的細(xì)胞有明顯地抑制PrPSc的蓄積作用，而且這種抑制有濃度依賴性［3］。

這些抗朊病毒的化合物在體外選擇性地與PrPC或PrPSc靶向結(jié)合，或靶向作用于PrPC→PrPSc的轉(zhuǎn)化過程，阻止PrPC轉(zhuǎn)化成PrPSc，從而抑制了朊病毒的增殖。然而，這些物質(zhì)在體外培養(yǎng)接種朊病毒的細(xì)胞模型中有效，有的且對(duì)動(dòng)物模型有毒性，或在體內(nèi)治療效率極低，甚至無效［4］。

2 LRP／LR受體特異性抗體治療

至今發(fā)現(xiàn)的朊蛋白細(xì)胞表面受體有很多種，近年來，朊蛋白37－kDa／67－kDa層粘連蛋白受體及其前體（LRP／LR）備受關(guān)注，體外證明該受體是朊病毒分子PrPSc在細(xì)胞內(nèi)復(fù)制和聚集所必需的蛋白。因此，在理論上利用LRP／LR的特異性抗體與LRP／LR蛋白特異性結(jié)合可以抑制或者阻斷PrPSc在細(xì)胞內(nèi)的聚集。體外試驗(yàn)已證明Anti－LRP／LR抗體W3可以抑制PrPSc在感染癢病病毒的神經(jīng)細(xì)胞ScN2a內(nèi)的聚集［5］；在體內(nèi)試驗(yàn)中，將 LRP／LR的重組單鏈抗體片段（single chain antibodies，scFV）注射免疫C57BL／6小鼠后，降低了PrPSc在外周組織內(nèi)的增殖，且明顯延長(zhǎng)了小鼠的臨床發(fā)病潛伏期［6］。利用基因工程的方法，將表達(dá)LRP／LR抗體scFV的基因克隆到改造的腺病毒（adeno－associated virus，AAV）基因內(nèi)，然后將組裝成的AAV擴(kuò)增子經(jīng)腦內(nèi)注射到C57BL／6小鼠的海馬，使LRP／LR的抗體scFV基因在體內(nèi)得到表達(dá)。產(chǎn)生的LRP／LR抗體scFV與層粘連蛋白的特異性結(jié)合能夠抑制PrPSc在小鼠外周組織細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制和增殖，延長(zhǎng)了小鼠的臨床發(fā)病潛伏期，而且在該小鼠脾臟內(nèi)也檢測(cè)到了AAV基因［7］。這表明朊蛋白特異性受體LRP／LR抗體的應(yīng)用可以作為朊病毒病治療的一種手段。此外，以腺病毒基因作為載體運(yùn)載的表達(dá)LRP／LR的抗體scFV的基因能夠在機(jī)體各組織中分布，且能產(chǎn)生有效的主動(dòng)免疫抗體，也可以作為朊病毒病的一種潛在治療方法。

3 RNA干擾

RNA干擾是翻譯后修飾水平上沉默內(nèi)源性基因最有力的技術(shù)。在幾種神經(jīng)退行性疾病的動(dòng)物模型中已經(jīng)表現(xiàn)出治療的潛力。慢病毒介導(dǎo)的抗PrP的shRNA的表達(dá)有效地抑制了朊病毒的復(fù)制延長(zhǎng)了癢病感染小鼠的存活時(shí)間［8］。慢病毒載體介導(dǎo)的LRP／LR基因特異的干擾siRNA腦內(nèi)注射癢病毒株RML感染的LC57BL／6小鼠后，也能夠延長(zhǎng)小鼠的臨床發(fā)病潛伏期［9］。RNA干擾已成為神經(jīng)類疾病極有效的治療方法。

4 免疫治療

朊病毒不能引起機(jī)體內(nèi)產(chǎn)生主動(dòng)免疫抗血清，因此不能夠利用疫苗來治療。最早提出的朊病毒病抗體治療方法是基于1988年的一項(xiàng)體外研究：體外感染癢病病毒的細(xì)胞與抗PrP抗體孵育一段時(shí)間后降低了該細(xì)胞的傳染性［10］。已有研究發(fā)現(xiàn)，PrP抗體在體外培養(yǎng)的細(xì)胞模型和動(dòng)物模型體內(nèi)都可以降低朊病毒的感染性。PrP抗體以及重組的抗原結(jié)合片段（antigen－binding fragment，F(xiàn)ab）可以抑制朊病毒在ScN2a細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制和增殖。抗PrP中間片段的抗體（PrP90－110，132－156）不僅可以有效抑制癢病病毒感染細(xì)胞，還能降低感染鼠脾臟內(nèi)的PrPSc［11］。RML朊病毒株感染的小鼠如果在早期就應(yīng)用單克隆抗體ICSM35（PrP143－153）和ICSM18（PrP93－105）進(jìn)行干預(yù)，能夠減弱發(fā)病狀況，并且沒有副作用［12］。

抗體治療方法已經(jīng)成為朊病毒病治療研究的一個(gè)挑戰(zhàn)。大量體外試驗(yàn)研究已經(jīng)證明，PrP抗體具有抗朊病毒效果，但是在動(dòng)物體內(nèi)進(jìn)行應(yīng)用時(shí)，還要考慮抗體分子大小、抗體給予途徑、抗體在機(jī)體內(nèi)的擴(kuò)散性等因素。

4.1 不同類型的抗體 在動(dòng)物模型體內(nèi)，直接注射抗PrP全長(zhǎng)的抗體分子可以降低朊病毒感染性，但是由于全長(zhǎng)抗體IgG分子量很大，不易穿過血管進(jìn)入組織，尤其難以穿過BBB，進(jìn)入腦組織。此外，機(jī)體內(nèi)存在復(fù)雜的生物級(jí)聯(lián)反應(yīng)對(duì)抗體的應(yīng)用也造成了一定的困擾，例如，研究發(fā)現(xiàn)腦內(nèi)注射抗PrP的IgG抗體之后，IgG與PrPC的交聯(lián)作用在體內(nèi)造成了海馬神經(jīng)元和小腦神經(jīng)元的死亡［13］。而且由于全長(zhǎng)抗體在機(jī)體內(nèi)擴(kuò)散性能較差，如果用以治療朊病毒病，只有在外周感染的同時(shí)或感染之后立即注射抗體，才能夠阻止朊病毒從外周組織轉(zhuǎn)移到CNS，在一定程度上抑制其致病性?；谌L(zhǎng)抗體分子較大，有人又研究出了單價(jià)小分子抗體片段Fab，但是Fab也不易穿過BBB。因此，全長(zhǎng)的抗體和Fab都不宜直接注射到動(dòng)物體內(nèi)，以產(chǎn)生被動(dòng)免疫來預(yù)防和治療朊病毒病。另外還有一種可變區(qū)的scFV，這是一種單價(jià)小抗體，只含抗體的重鏈和輕鏈的可變區(qū)，兩個(gè)可變區(qū)之間由一段融合多肽連接。這種抗體保留了抗原結(jié)合特異性，且應(yīng)用基因工程的手段能夠使scFV在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)并被分泌到細(xì)胞外。Campana等人分別利用重組的病毒基因載體AAV和慢病毒將重組的朊蛋白抗體D18scFV轉(zhuǎn)染到ScN2a細(xì)胞和scGT1細(xì)胞內(nèi)，結(jié)果AAV－D18scFV和慢病毒－D18scFV都降低了細(xì)胞內(nèi)PrPSc的量［14］。

4.2 抗體在機(jī)體內(nèi)的擴(kuò)散性 動(dòng)物機(jī)體通過直接注射的抗體能夠獲得被動(dòng)免疫，該類抗體在機(jī)體內(nèi)的擴(kuò)散性不好，通常難以穿過血管進(jìn)入到機(jī)體各組織，尤其難以進(jìn)入CNS。因而，抗體能夠在機(jī)體內(nèi)擴(kuò)散是抗體治療朊病毒病的關(guān)鍵條件。全長(zhǎng)抗體和Fab在體內(nèi)的擴(kuò)散性不好，而病毒基因載體運(yùn)輸scFV的方法能夠產(chǎn)生較好的擴(kuò)散性，如改造的AAV、HSV或lentivirus可以攜帶scFV抗體基因在機(jī)體組織內(nèi)擴(kuò)散，并能夠穿過BBB。與IgG和Fab相比，scFV抗體具有更廣泛的應(yīng)用價(jià)值。Wuertzer等人利用重組的AAV2作為病毒載體運(yùn)輸D18scFV抗體到朊病易感小鼠的CNS內(nèi)，同時(shí)外周接種感染朊病毒，明顯延遲了小鼠的臨床發(fā)病潛伏期，且免疫組化和Western blot結(jié)果顯示CNS內(nèi)PrPSc的量降低［15］。值得注意的是，應(yīng)用病毒載體使朊病毒抗體進(jìn)入到腦組織內(nèi)的方法并不可能完全阻止朊病毒感染，因?yàn)閭魅拘噪貌《镜膹?fù)制主要發(fā)生在外周淋巴組織內(nèi)，PrPSc仍然能夠在外周組織內(nèi)復(fù)制，并可能通過神經(jīng)入侵的方式從外周組織轉(zhuǎn)移到CNS。由于PrPC→PrPSc的蛋白結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化過程還未完全弄清楚，對(duì)于抗體治療方法，要找到確切的、能夠特異性阻斷朊病毒增殖的抗體，并且要使抗體能夠在機(jī)體組織內(nèi)擴(kuò)散，穿過BBB在CNS內(nèi)擴(kuò)散，還需要大量的科學(xué)試驗(yàn)來不斷研究和探索。

4.3 抗體的被動(dòng)免疫和主動(dòng)免疫 直接給動(dòng)物注射抗體用以治療朊病毒病時(shí)，要生產(chǎn)大量的單抗，而生產(chǎn)單抗對(duì)生物學(xué)技術(shù)的要求較高，且需要大量的經(jīng)費(fèi)。因此，為了研究出一種真正具有可行性的治療方法，科學(xué)家們結(jié)合被動(dòng)免疫和主動(dòng)免疫，研究出了一種由病毒基因載體運(yùn)載的靶向結(jié)合PrP抗體的治療方法，該方法中將朊病特異抗體的單價(jià)小抗體分子scFV基因克隆到病毒載體如AAV、慢病毒或單純皰疹病毒（Herpes simplex virus，HSV），然后經(jīng)病毒包被將組裝成的病毒擴(kuò)增子注射到動(dòng)物體內(nèi)，使scFV抗體在動(dòng)物機(jī)體內(nèi)長(zhǎng)期表達(dá)，并保持其免疫特異性。這種方法產(chǎn)生的scFV特異抗體能夠被分泌到細(xì)胞外，且能從注射部位擴(kuò)散到機(jī)體其他部位，并穿過BBB在CNS內(nèi)擴(kuò)散，達(dá)到了主動(dòng)免疫治療目的，克服了前面提到的被動(dòng)免疫擴(kuò)散性差的弊端。此外，病毒基因作為載體運(yùn)輸抗體基因已成為一種有前景的治療手段，用于治療多種神經(jīng)退行性疾病，如利用HSV基因載體治療帕金森病。

綜上所述，科學(xué)家已經(jīng)在朊病毒病治療方面的研究上做了很多努力，這些發(fā)現(xiàn)開創(chuàng)了朊病毒病和其他神經(jīng)退行性疾病治療領(lǐng)域的一個(gè)新途徑。雖然取得了一定的成果，但很多結(jié)論都是基于試驗(yàn)動(dòng)物模型得到，至今仍未發(fā)現(xiàn)能應(yīng)用于市場(chǎng)的有效藥物或治療方法。因此，仍然需要科學(xué)的不斷創(chuàng)新和探索，繼續(xù)研究PrPC→PrPSc的轉(zhuǎn)化過程，PrPSc的轉(zhuǎn)運(yùn)和清除作用，這樣才能夠在朊病毒病治療上有更大的突破。

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