中國(guó)傳統(tǒng)醬油生產(chǎn)用米曲霉菌種研究進(jìn)展

紀(jì)鳳娣， 魯 緋， 程永強(qiáng)

(1．北京一輕研究院食品與工業(yè)研究所，北京 101111;2．中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)院，北京 100083)

中國(guó)傳統(tǒng)醬油生產(chǎn)用米曲霉菌種研究進(jìn)展

紀(jì)鳳娣1， 魯 緋1， 程永強(qiáng)2

(1．北京一輕研究院食品與工業(yè)研究所，北京 101111;2．中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)院，北京 100083)

米曲霉是我國(guó)傳統(tǒng)醬油生產(chǎn)用關(guān)鍵菌種．關(guān)于米曲霉菌株選育的研究主要包括，高產(chǎn)蛋白酶菌株選育技術(shù)研究、酶學(xué)特性研究、產(chǎn)酶影響因素研究等方面．高產(chǎn)蛋白酶菌株的選育為研究重點(diǎn)．雖然，研究均顯示經(jīng)過(guò)改良的菌株性能超過(guò)了原始出發(fā)菌株，但是成果仍然局限于實(shí)驗(yàn)室理論分析．我國(guó)科研人員仍需努力，加強(qiáng)對(duì)米曲霉菌株在工業(yè)化生產(chǎn)中實(shí)際應(yīng)用效果的研究．

醬油;米曲霉;選育;酶學(xué)特性;基因

米曲霉(Aspergillus oryzae)是我國(guó)傳統(tǒng)發(fā)酵調(diào)味食品—醬油釀造用關(guān)鍵菌種．目前，我國(guó)80%以上的醬油生產(chǎn)企業(yè)，均采用米曲霉制曲，為后續(xù)發(fā)酵過(guò)程提供所需的各種酶系，如蛋白酶、淀粉酶、糖化酶、纖維素酶、植酸酶等．醬油的品質(zhì)、生產(chǎn)效益等與釀造醬油用的米曲霉有十分密切的關(guān)系，因此，本文對(duì)我國(guó)醬油生產(chǎn)用米曲霉菌種的研究現(xiàn)狀進(jìn)行概述，為企業(yè)醬油產(chǎn)品質(zhì)量的提高及工藝控制提供依據(jù)．

米曲霉(Aspergillus oryzae)是一種好氣性真菌，屬于半知菌亞門、曲霉屬，菌絲一般呈黃綠色，后為黃褐色，分生孢子梗生長(zhǎng)在厚壁的足細(xì)胞上，分生孢子頭呈放射形、項(xiàng)囊球形或瓶形，小梗一般為單層，分生孢子球形平滑，少數(shù)有刺，適宜的培養(yǎng)溫度為37℃．米曲霉的菌絲由多細(xì)胞組成，是一類產(chǎn)復(fù)合酶的菌株．目前，我國(guó)醬油生產(chǎn)絕大多數(shù)采用滬釀3.042米曲霉制曲，其具有對(duì)營(yíng)養(yǎng)要求較粗放、生長(zhǎng)快、蛋白酶活力較高、產(chǎn)孢子量大、不產(chǎn)毒素等特點(diǎn)．已有研究表明［1－2］，在現(xiàn)有制曲條件下，其所產(chǎn)蛋白酶以中性和堿性蛋白酶為主，其他酶系不足，導(dǎo)致原料中各種成分如淀粉質(zhì)原料不能完全被分解，風(fēng)味不足．選育醬油釀造用新菌株，一直以來(lái)都是國(guó)內(nèi)科研工作的熱點(diǎn)．

1 米曲霉菌株篩選研究

通過(guò)各種方式誘變(紫外線、離子注入法、原生質(zhì)體融合、微波)獲得性能優(yōu)良的菌株是普遍采用的方法．早在30多年前，科學(xué)工作者就對(duì)米曲霉滬釀3.042進(jìn)行了純化復(fù)壯，挑選出蛋白酶活力高、生長(zhǎng)快、易管理、原料利用率高的菌種，但這仍無(wú)法滿足醬油生產(chǎn)發(fā)展的需要．

1.1 物理、化學(xué)誘變研究

大量科研人員對(duì)高產(chǎn)蛋白酶米曲霉菌株篩選進(jìn)行了研究．有研究采用紫外線、氯化鋰和硫酸二乙脂(DES)復(fù)合誘變方法，以米曲霉M-2為出發(fā)菌株，篩選得到酸性蛋白酶高產(chǎn)突變株［3］．利用紫外線、高溫、亞硝酸單獨(dú)或復(fù)合處理，以米曲霉A.oryzae-I為出發(fā)菌株，得到的突變株蛋白酶活力比原始菌株提高了33.12%［4］．以自選米曲霉為出發(fā)菌株，采用紫外線誘變篩選出的突變株蛋白酶活力提高了1.47倍［5］．以米曲霉l-7.3為出發(fā)菌株，通過(guò)紫外誘變，結(jié)合含有不同制霉菌素藥物濃度的PDA培養(yǎng)基，得到了酸性蛋白酶和中性蛋白酶活分別提高了230.10和17.5%的突變株［6］．以醬油釀造用菌粉為出發(fā)菌，經(jīng)紫外線誘變及控溫培養(yǎng)處理后，獲得遺傳穩(wěn)定性較好的變異菌株，酶活力提高了77.84%［7］．以滬釀3.042為出發(fā)菌株經(jīng)過(guò)快中子、鈷60、Y射線、紫外線、甲基磺酸乙酯(EMS)、氯化鋰等交替誘變育種，篩選出新菌株UE336-2米曲霉．其應(yīng)用于生產(chǎn)種曲孢子數(shù)可達(dá)5×109個(gè)/g以上，接種量0.4% ～0.5%，成曲中性蛋白酶活力比對(duì)照菌提高70% ～100%，其他酶系相仿［8］．利用紫外線誘變篩選出高產(chǎn)纖維素酶米曲霉菌株，突變株纖維素酶活力是原始株的1.84倍［9］．以野生米曲霉K61進(jìn)行紫外誘變，篩選出蛋白酶活力高且遺傳性能穩(wěn)定的突變株Y29，性能優(yōu)越的米曲霉滬釀3.042菌株［10］．以滬釀3.042為出發(fā)菌株，經(jīng)紫外誘變與化學(xué)誘變，篩選得到變異菌株蛋白酶活性比原菌株提高了110%，耐溫性能較強(qiáng)，遺傳穩(wěn)定性較好［11］．

1.2 新技術(shù)應(yīng)用篩選研究

采用傳統(tǒng)的物理、化學(xué)方法篩選菌株，勞動(dòng)量巨大，誘變率低．隨著新的誘變技術(shù)的產(chǎn)生，顯著提高了菌株的誘變率．有報(bào)道以滬釀3.042米曲霉原生質(zhì)體制備，利用經(jīng)過(guò)分生孢子的原生質(zhì)體紫外線－氯化鋰、NTG復(fù)合誘變得到 8株突變株［12］．潘力等［13］利用原生質(zhì)體，進(jìn)行多親株雙滅活PEG介導(dǎo)融合，獲得一株融合菌株FII4l，酶活力比出發(fā)株提高1.76倍，且遺傳穩(wěn)定．王華等［14］采用高壓誘變技術(shù)對(duì)米曲霉菌株進(jìn)行處理，得到了蛋白酶及淀粉酶活性顯著提高的菌株．

雖然對(duì)醬油生產(chǎn)用微生物米曲霉進(jìn)行誘變選育的研究報(bào)道眾多，并且大都獲得了性能優(yōu)良的新菌株，但是，目前并沒(méi)有應(yīng)用于生產(chǎn)獲得成功的報(bào)道．

2 提高米曲霉酶活的影響因素研究

碳源、氮源、初始pH值及溫度等均能影響米曲霉所產(chǎn)酶系及酶活．胡學(xué)智等［15］發(fā)現(xiàn)無(wú)機(jī)氮、拌水率、無(wú)機(jī)鹽均能促進(jìn)米曲霉3.042產(chǎn)酶，提高大豆蛋白的消化率．楊世平等［16］則得到麩皮:豆粕粉=4∶1，水的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為60%，最佳培養(yǎng)溫度為30℃，最佳培養(yǎng)時(shí)間為48 h為產(chǎn)中性蛋白酶的適宜培養(yǎng)條件．鄧靖等［17］研究表明麩皮∶葡萄糖∶水 =9∶1∶5，接種3 mL孢子菌懸液，28℃培養(yǎng)72 h時(shí)酶活最高．李秀婷等［18］研究認(rèn)為產(chǎn)酶的最佳碳、氮源分別為麩皮及蛋白胨，最適初始pH值為6.0～8.0，溫度為30℃．劉曉蓉等［19］研究結(jié)果表明，豆粕含量20%，NaCl濃度2%，初始pH6.6，接種量3‰，31℃培養(yǎng)108 h，淀粉酶活最大．張艷芳等［20］用米曲霉40188制曲最佳時(shí)間為50～72 h，中性蛋白酶及a-淀粉酶最高．林祖申［8］篩選出新菌株UE336-2米曲霉，28 h制曲釀制醬油全氮利用率平均提高7.1%．傅力等［21］報(bào)道米曲霉菌株UF366最適的制曲培養(yǎng)基為豆粕∶麩皮∶水 =6∶4∶5，培養(yǎng)溫度 33 ℃，培養(yǎng)時(shí)間32 h，翻曲2次，接種量4‰可得到最高的蛋白酶活．

3 菌株蛋白酶、淀粉酶酶學(xué)特性研究

醬油的產(chǎn)生是在各種酶系的作用下將原料中的蛋白質(zhì)、淀粉、纖維素等成分降解而形成．因此，醬油的品質(zhì)與釀造醬油用米曲霉所產(chǎn)酶系的性質(zhì)有十分密切的關(guān)系．

3.1 蛋白酶學(xué)特性研究

醬油生產(chǎn)中最注重原料利用率的高低，因此，蛋白酶活性高是米曲霉菌株必須具備的一個(gè)重要特性．一直以來(lái)，中性蛋白酶活作為一個(gè)重要指標(biāo)用于指導(dǎo)生產(chǎn)，但是，研究發(fā)現(xiàn)，酸性蛋白酶對(duì)原料中蛋白質(zhì)的降解及風(fēng)味的形成也發(fā)揮著重要的作用．近年來(lái)，對(duì)于米曲霉菌株所產(chǎn)蛋白酶酶學(xué)特性的研究開(kāi)始活躍，隨著對(duì)不同菌株酶學(xué)特性研究的深入，為指導(dǎo)實(shí)際生產(chǎn)提供了有力的支持．

黨敏娜等［22］研究發(fā)現(xiàn)食鹽對(duì)不同米曲霉菌株所產(chǎn)中性蛋白酶活力的影響不同，在實(shí)際醬油發(fā)酵中的鹽濃度下測(cè)定中性蛋白酶活力才能更客觀、準(zhǔn)確地反映菌種最適合生產(chǎn)實(shí)際使用．湯鳴強(qiáng)等［23］研究表明，米曲霉F-81產(chǎn)中性蛋白酶最適作用溫度為60℃，Cu2+、Fe3+強(qiáng)烈抑制酶活性．張淑娟等［24］分析發(fā)現(xiàn)米曲霉令野菌株產(chǎn)蛋白酶最適溫度為40℃，40℃保溫5 h，剩余酶活力為54%，NaCl對(duì)其有非競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用．李艷麗等［25］發(fā)現(xiàn)米曲霉ZW-06產(chǎn)中性蛋白酶，最適溫度45℃，最適作用pH為6.5和9.0，Mg2+，Mn2+和 Ca2+對(duì)蛋白酶有強(qiáng)烈的激活作用，F(xiàn)e2+和Cu2+有強(qiáng)烈抑制作用．林祖申［8］對(duì)米曲霉菌株UE336-2所產(chǎn)蛋白酶研究表明，最適pH值為6～9，最適溫度50℃，但失活較快，在含有食鹽7%左右、溫度40℃ ～45℃為宜．米曲霉40188產(chǎn)中性蛋白酶，最適pH分別為7～8，中性蛋白酶酶活隨著鹽濃度的增加呈下降趨勢(shì)［20］．最近，研究發(fā)現(xiàn)［26－27］，醬油成曲中含有不同分子量大小的蛋白酶，分別作用于蛋白質(zhì)的不同位點(diǎn)，這一發(fā)現(xiàn)，為更具有針對(duì)性地提高醬油生產(chǎn)技術(shù)，提供了理論支持．

3.2 淀粉酶酶學(xué)特性研究

近年來(lái)，人們開(kāi)始意識(shí)到淀粉酶對(duì)醬油風(fēng)味的形成有重要貢獻(xiàn)，有研究指出醬油成曲中至少有4種不同分子量的淀粉酶組分，其中活性最高的淀粉酶組分分子質(zhì)量是52 000 u，為a-淀粉酶，最適pH值6.2，最適溫度為 50 ℃［28］．劉曉蓉等［19］對(duì)米曲霉1228產(chǎn)a-淀粉酶研究發(fā)現(xiàn)，該酶最適溫度為55℃，最適pH 值為 5.0，Ca2+對(duì)酶有激活作用，F(xiàn)e2+、Fe3+、Mn2+、Ba2+和Cu2+對(duì)其有不同程度的抑制．張艷芳等［20］對(duì)米曲霉40188產(chǎn)a-淀粉酶的研究表明，最適pH 6～8，酶活在40℃穩(wěn)定，熱穩(wěn)定性較強(qiáng)，耐鹽性較強(qiáng)．

4 結(jié)束語(yǔ)

新技術(shù)的不斷涌現(xiàn)，為我們獲得性能優(yōu)良的菌株提供了越來(lái)越有力的支撐，雖然，已有研究獲得了很多性能優(yōu)良的新菌株，遺憾的是至今未見(jiàn)成功應(yīng)用于生產(chǎn)的報(bào)道．日本已經(jīng)通過(guò)基因組比較及轉(zhuǎn)錄分析發(fā)現(xiàn)了米曲霉對(duì)原料的有效降解機(jī)制［29］．我國(guó)科研人員仍需努力，進(jìn)一步探討米曲霉菌株的基因與產(chǎn)品質(zhì)量的關(guān)系．

［1］黃持都，魯緋，袁圓，等．季節(jié)性制曲效果比較研究［J］．中國(guó)釀造，2010(2):107-110．

［2］袁圓．低鹽固態(tài)醬油制取過(guò)程動(dòng)態(tài)變化研究［D］．北京:中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)，2010．

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［18］李秀婷，趙進(jìn)，魯緋，等．米曲霉固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)酶條件及酶活力研究［J］．中國(guó)釀造，2009(2):26-28．

［19］劉曉蓉，連曉蔚，朱美娟．米曲霉1228產(chǎn)a-淀粉酶特性的研究［J］．中國(guó)調(diào)味品，2009，34(4):36-38，75．

［20］張艷芳，陶文沂．米曲霉40188產(chǎn)中性蛋白酶、a-淀粉酶特性的研究［J］．食品與發(fā)酵工業(yè)，2008，34(5):35-37．

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［23］湯鳴強(qiáng)，鄭挺，曾小芳，等．釀造醬油米曲霉產(chǎn)中性蛋白酶提取與酶學(xué)性質(zhì)研究［J］．中國(guó)調(diào)味品，2008(2):38-40，50．

［24］張淑娟，田利強(qiáng)，王輅，等．米曲霉菌今野菌株所產(chǎn)蛋白酶性質(zhì)的研究［J］．中國(guó)調(diào)味品，2001(11):15-17．

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［28］武金霞，閆博，張賀迎．醬油成曲淀粉酶組分的鑒定及單組分的分離純化［J］．中國(guó)調(diào)味品，2010(8):48-50．

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(責(zé)任編輯:王 寬)

Study on Aspergillus Oryzae Breeding in Production of Chinese Traditional Soy Sauce

JI Feng-di1， LU Fei1， CHENG Yong-qiang2
(1．Department of Food and Industrial Technology，Beijing Industrial Technology Research Institute，Beijing 101111，China;2．College of Food Science and Nutritional Engineering，China Agricultural University，Beijing 100083，China)

Aspergillus oryzae is the key organism in production of traditional soy sauce．The research of Aspergillus oryzae breeding included the strain breeding of high productivity of protease，enzyme characteristic，and conditions of enzymes producing，focusing on the strains of high productivity of protease．Though these studies have shown that the strain performance was improved comparing the original strain，the research was still limited to laboratory theoretical analysis．The application of Aspergillus oryzae in industrial production of soy sauce need further exploration．

soy sauce;Aspergillus oryzae;breeding;enzyme characteristic;gene

TS201.2

A

1671-1513(2012)04-0041-03

2012-04-16

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(31171738)．

紀(jì)鳳娣，女，副研究員，博士，主要從事食品發(fā)酵技術(shù)方面的研究．